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        [碩士論文] 肖慧
        野生動植物保護與利用 東北林業大學 2018(學位年度)
        摘要:SOX9基因屬于SOX基因家族,與哺乳動物胚胎發育、性別決定、人類遺傳綜合征和惡性腫瘤的發生有密切關系。MicroRNA PC-5P-1090(PC-1090)是在鹿茸生長點茸皮中新發現的小分子RNA。為了驗證SOX9基因是否是PC-1090的直接作用靶基因,本研究構建含有SOX93'UTR的野生型重組質粒(pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT)和突變型重組質粒(pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT);將pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT、pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT分別與1090mimics和control mimics共轉染293T細胞,Western blot檢測轉染后293T細胞中熒光素酶基因的表達量;分別以1090mimics與control mimics轉染Huh-7細胞(表達內源性的SOX9),Western blot檢測轉染后Huh-7細胞中SOX9蛋白表達的變化。
          結果顯示:經測序證實熒光素酶報告載體pMIR-Report-SOX9-3'UTR-WT和pMIR-Report-SOX9-3'UTR-MUT構建成功;Western blot結果顯示,共轉染PC-1090mimics與SOX93'UTR野生型重組質粒的293T細胞組,熒光素酶的表達量明顯下降,而其他對照組熒光素酶的表達量無顯著變化;與轉染control mimics的Huh-7細胞組相比,轉染1090mimics的Huh-7細胞中SOX9蛋白的表達顯著降低。
          結論為PC-1090具有生物學功能,且和SOX93'UTR上的位點特異性結合,靶向負調控SOX9基因的表達。
        [碩士論文] 駱孟
        作物遺傳育種 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:全基因組關聯研究(GWASs)已被成功鑒定了與人類、動物和植物復雜性狀相關聯的數以千計的遺傳變異。少數的GWAS結果則能夠完全確定影響復雜性狀的所有遺傳因素,而這些遺傳因素是由多種遺傳和環境因素相結合引起的。但使用當前的分析技術大都存在遺傳力丟失(missing heritability)即解釋能力低下的窘境。通常,GWAS方法依賴混合模型進行群體結構校正,以避免性狀與遺傳標記之間的虛假關聯。而多數單位點分析難于應對復雜性狀多基因共同協同作用(包括上位性)的本質。因此,進一步研究基因相互作用可能有助于檢測到不能從單變量方法檢測到的遺傳變異。提出和開發能夠同時檢測加性效應及上位性效應模型的新方法很有必要。然而除了發現與性狀相關的遺傳變異位點外,人們越來越感興趣的是從植物育種、動物育種和人群的個體基因型數據中預測復雜性狀的表型。這些預測是基于SNPs的選擇,并估計他們在樣本中的效應大小,然后在具有已知表型的獨立樣本中進行驗證并且最終應用于未知表型的樣本。本研究提出了一種新的統計分析方法—重復篩選法(Iterative screen regression,ISR)。它首先建立新的模型選擇標準RIC(回歸信息標準),然后用特殊的變量篩選過程,使RIC最優化從而實現遺傳效應解析的最優化。主要將其運用在檢測上位性和加性效應的全基因組關聯分析(GWAS)和基因組選擇(GS),研究內容包括以下三部分:
          (1)所有常見的全基因組關聯(GWA)方法都依賴于群體結構校正,以避免錯誤的基因型與表型的相關聯。然而,群體結構校正是一種嚴厲的懲罰措施,這也阻礙了對真實關聯的鑒定。使用重復篩選法(ISR),可實現同時將多個標記加到模型中,能夠適當地矯正了GWAS中個體間的群體結構和潛在的親緣關系。模擬實驗的結果表明,重復篩選法(ISR)在統計功效(敏感度)與假發現率(FDR)和特異度優于現有的多位點線性(混合)模型和單位點線性(混合)模型,并且估計線性效應具有更高精度。還通過將其應用于水稻,遠緣雜種小鼠和擬南芥數據來展示它的實用性。結果表明它可以多定位到了其他方法無法檢測到的新關聯位點。我們的ISR方法為多位點GWAS提供了一種新的選擇,它不僅計算速度快,而且也可以有效地分析大型數據集(n>100000)。
          (2)基因與基因的相互作用,也稱為上位性,其調控著不同物種的許多復雜性狀。隨著低成本基因分型的可用性,現在可以在全基因組范圍內研究上位性。然而,鑒定全基因組上位性是一種超飽和多元回歸問題,難度較大、效果不佳。ISR方法則可以適用于此類問題的復雜性狀的遺傳效應解析。通過兩套真實基因型模擬表型數據(人類與水稻),另外還選擇了植物中最常用的群體IMF2(水稻)、MAGIC(大麥),用ISR方法來進行解析相關復雜性狀的遺傳效應。模擬表明,就檢測功效和一類型錯誤而言,該方法顯著優于常用的窮舉搜索方法(PLINK)。在水稻RIL群體中,QTL全模型包括1619個標記的加性和顯性以及所有的成對互作,總共超過500萬個效應項。QTL關聯分析在兩年內分別確定了42、45、38和48個與四種性狀,即單株穗數,每穗粒數,粒重和單株產量顯著關聯的QTLs。大多數鑒定的QTL都是二基因的相互作用。在大麥MAGIC群體中,全模型包括3413個標記包含互作效應在內所有效應項超過500多萬。QTL關聯作圖鑒定了與大麥開花期(FT)性狀顯著關聯的21個QTLs。還觀察到,檢測結果(關聯的主效和上位性效應的基因組區域)與已報道的與水稻和大麥及其密切相關物種的復雜性狀的已知候選基因是一致的。研究結果表明,ISR是一種用于檢測多位點模型中的位點間相互作用的有效方法。
          (3)盡管全基因組關聯研究已經鑒定出與各種復雜性狀和疾病相關的遺傳標記,大多數預測表型的能力任有限,這些關聯的基因位點只是解釋了表型變異的一小部分。利用基因型數據對復雜性狀進行準確的遺傳預測可以促進動物和植物育種計劃中的基因組選擇。由于大多數復雜性狀具有多基因結構,因此準確的基因組預測通常需要通過多基因方法一起模擬所有遺傳變異。在此,同樣還運用ISR方法來進行基因組模擬及表型預測。并應用ISR對牛、水稻、小麥和小鼠四種物種在內的12個性狀全基因組預測。研究結果表明,ISR方法預測力比幾種常用的多基因預測方法高(如,rrBLUP、BSLMM和BayesC等)及穩定。
        [碩士論文] 杜應雯
        作物遺傳育種 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:絕大多數動植物重要性狀是由少數較大效應的基因和較多效應較小的基因控制,并受環境修飾的數量性狀。為在動植物育種中更好地利用和改良這些性狀,需要深入解析這些性狀的遺傳基礎。目前,關聯分析是解析數量性狀遺傳基礎的主要途徑。
          隨著測序技術的飛速發展,標記數p遠大于樣本容量n的超高維標記小樣本數據已成常態。這無疑加重了關聯分析的計算壓力。如何在有限的樣本容量下快速準確地從海量標記中篩選出與數量性狀顯著關聯的位點成為一項重大挑戰。當前廣泛應用的關聯分析方法是基于多基因背景和群體結構控制的單位點全基因組掃描。這些方法不能同時估計所有標記效應,只能在群體結構與多基因背景控制下單獨估計每個標記效應。這些估計值可能是有偏的。為解決這一問題,本研究利用奇異值分解、SCAD和經驗Bayes估計、多位點遺傳模型和似然比檢驗,提出了一種多位點全基因組關聯分析新方法,通過三個Monte Carlo模擬試驗和擬南芥開花時間相關性狀分析,來證實新方法的有效性。主要結果如下:
          1、新方法分為兩步:1)潛在關聯標記的選擇。通過奇異值分解獲得所有標記的效應值,效應值較大的標記為可能潛在關聯標記,進一步用SCAD壓縮估計選擇出潛在關聯標記;2)顯著QTN(quantitative trait nucleotide)的鑒定。將潛在關聯標記放入多位點模型中,用經驗Bayes估計這些潛在關聯標記效應,當效應絕對值大于10-5時用似然比檢驗鑒定其與性狀的顯著關聯性。這種方法稱為基于奇異值分解和SCAD估計(Singular value decomposition-SCAD screening plus empirical Bayes,S3-EB)的多位點關聯分析方法。
          2、通過三個Monte Carlo計算機模擬試驗來驗證S3-EB的有效性。在第一個模擬試驗中,從199個擬南芥品系216130個SNP的實際關聯群體中隨機抽取10000個SNP作為模擬關聯群體的基因型。在稀有等位基因頻率等于0.3的6個SNP上設置了6個模擬QTNs,其遺傳率分別設為0.1、0.05、0.05、0.15、0.05和0.05。群體平均數和誤差方差均設置為10。通過模擬QTN基因型值和隨機誤差獲得199個品系的模擬表型觀察值,并重復1000次。用S3-EB、mrMLM、EMMA和FarmCPU四種方法分別分析每個模擬樣本數據,結果表明:1)用上述四種方法檢測6個模擬QTNs的平均功效分別為74.8、67.03、46.0和41.87(%),成對t檢驗表明:S3-EB的統計功效顯著高于另外三種方法(P-值介于0.0036與0.0063之間);2)6個模擬QTNs的平均均方誤差(mean squared error,MSE)分別為0.1064、0.0934、0.5432和0.2824,成對t檢驗表明:S3-EB的MSE顯著低于EMMA(P-值等于0.015),但與mrMLM和FarmCPU無顯著差異(P-值分別等于0.3199和0.1549);3)上述四種方法的計算時間分別為0.79、4.01、68.77和5.12小時;4)四種方法的假陽性率分別為0.0489、0.0167、0.0325和0.0178(%),處于同一數量級。
          若在第一個模擬試驗中分別添加多基因背景和上位性背景,以研究這些背景干擾對S3-EB的QTN檢測功效和參數估計精度的影響。結果表明:這些結果與第一個模擬試驗結果趨勢一致。
          綜上所述,新方法通過奇異值分解,將運算維度由計算數十萬計SNP標記效應個數降低為計算數干計樣本容量效應數,快速獲得同一模型下全部標記效應值,有利于潛在關聯變量選擇,提高了統計功效和參數估計精度,縮短了計算時間,使假陽性率與Bonferroni矯正方法處于同一量級,驗證了新方法的有效性。
          3、用上述四種方法分析了下載的199個擬南芥品系216130個SNP的開花時間相關性狀FLC、FRI、FT-GH和FT-Field。結果表明:1)上述四種方法檢測到與FLC顯著關聯標記數分別為15、21、0和6,計算時間分別為0.0083、0.0684、1.0767和0.0838小時;與FRI顯著關聯的標記數分別為6、8、33和5;與FT-GH顯著關聯的標記數分別為17、4、0和7;與FT-Field顯著關聯的標記數分別為17、24、0和9;2)建立數量性狀表型與顯著關聯標記間的多元線性回歸模型,FLC性狀四種方法的BIC值分別為336、328.2、596.5和521.3;FRI的BIC值分別為163.5、156.7、322.3和211.6;FT-GH性狀的BIC值分別為-321.2、-296.1、314.6和-465.0;FT-Field性狀的BIC值分別為30.4、318.9、306.9和156.6。新方法BIC值處于最小或者次小,說明新方法是相對較優的;3)在上述關聯標記±50kb范圍內,上述四種方法分別檢測到59、9、3和8個已報道的性狀相關基因,其中39個僅被S3-EB方法檢測到。這些結果也證實新方法的有效性。
          為了便于推廣應用該方法,在R環境下,基于附加包shiny,研制了S3-EB方法的應用程序,嵌入多位點關聯分析軟件包mrMLM,可在Windows、Mac和Linux系統下運行操作。
        [碩士論文] 王志丹
        計算機技術 北京交通大學 2018(學位年度)
        摘要:目前,人們通過探究不同的細胞譜系來深入地研究細胞重編程的機制原理。本文研究的細胞譜系為小分子誘導成纖維細胞分化為多功能干細胞。該譜系的細胞在培養過程中,細胞形態和位移變化較大,相應地識別單個細胞,預測細胞能否成功分化有較大難度,目前尚未有人以高準確率的方法實現該譜系細胞的預測。本文提出了一種全新的細胞譜系預測的方法:采用實時成像的方式,拍攝細胞分化的全過程,通過深度學習方法學習出不同細胞的形態差異,從而對細胞能否成功分化進行預測。該方法相比于傳統的人工判別,準確率較高。本文的主要工作分為如下三個方面:
          (1)細胞譜系圖像的識別和切割。本文使用優化后的邊緣檢測算法對圖像中的單個細胞對象進行邊緣識別,利用識別出的邊緣坐標自動地將單個細胞切割成細胞圖像塊。
          (2)細胞譜系圖像的異常檢測和差異性特征提取。本文提出了在細胞圖像分類任務中,首先對原始數據進行異常檢測,根據異常檢測的結果有針對性地采用數據處理和數據增強方法。同時,本文利用反卷積網絡可視化和特征篩選的方法找出不同種群細胞之間的5個差異性特征,分別為DNA強度、紋理熵、紋理相關性、DNA質量上四分值和圖像對比度。這有利于生物科學家在細胞培養實驗中更好地區分不同種群細胞。
          (3)基于深度學習的細胞譜系圖像預測。本文在AlexNet卷積神經網絡上加入Batch Normalization層,形成AlexNet-BN。相比于原始的AlexNet網絡,它降低了圖像像素特征之間絕對差異對結果的影響,強化了像素特征之間的相對差異,因此更適合本文的細胞譜系圖像分類任務。同時,針對陰性細胞數據量較少,不足以支持卷積神經網絡訓練的問題。本文將ImageNet數據庫上學出的深度網絡遷移過來,并在此基礎上進一步優化,使其自適應源域和目標域之間的差異。實驗結果表明,該方法在少量的細胞圖像訓練集上便取得了較好的分類效果。同時,在公共的眼底疾病數據集和肺炎X光圖像數據集上也具有較好的分類性能。
        [博士論文] 劉濤
        微生物學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated genes)系統是近年來發現的原核生物抵御入侵的病毒和質粒的獲得性免疫系統。冰島硫化葉菌REY15A編碼Ⅰ-A型和Ⅲ-B型CRISPR-Cas系統,其中Ⅰ-A型系統的免疫適應模塊從外源入侵的病毒和質粒等遺傳物質上獲取DNA片段作為免疫記憶插入到CRISPR陣列中,從而獲得針對特定外源入侵遺傳元件的抵抗能力。獲取間隔序列(即適應過程)是該系統的首要步驟,該過程需要Cas1、Cas2等蛋白將異己DNA片段加工、整合到CRISPR位點形成新間隔序列,然而參與此過程的蛋白及其調控機制尚不清楚。
          本研究首先揭示了冰島硫化葉菌Ⅰ-A型系統原發適應(de novo spacer acquisition)的轉錄調控機制。本研究發現Csa3a調控蛋白可以特異性結合csa1和cas1基因啟動子;更重要的是在超表達csa3a基因的菌株中檢測到csa1、cas1、cas2和cas4基因轉錄水平顯著升高,同時Csa1和Cas1蛋白表達量顯著增加。本研究進一步發現在含有csa3a超表達質粒的情況下,兩個CRISPR位點都能檢測到非常活躍的獲取單個間隔序列的現象。新間隔序列的PAM主要是CCN,并且前間隔序列的選擇是隨機和不定向的。這些結果闡明了Csa3a轉錄調控蛋白感應入侵外源遺傳元件并激活獲得免疫相關基因表達,最終從入侵遺傳元件上面獲取間隔序列的原發型免疫適應機制。
          本研究進一步揭示了Csa3a調控蛋白激活CRISPR RNA轉錄和DNA修復基因表達,以增強CRISPR適應和干涉的轉錄調控機制。本研究發現在冰島硫化葉菌Ⅰ-A型CRISPR-Cas系統中獲取間隔序列需要Csa1、Cas1、Cas2和Cas4四種蛋白,并且缺失加工成熟crRNA的基因或者干涉基因會導致菌株從自身基因組大量獲取間隔序列。轉錄組和蛋白質組分析顯示,超表達Csa3a蛋白可以激活獲取相關的cas基因以及包括解旋酶herA、核酸酶nurA和DNA聚合酶Ⅱ在內的DNA修復基因的表達,同時增強CRISPR RNA的轉錄。體外EMSA實驗表明,Csa3a蛋白能特異性結合到這些DNA修復基因的啟動子區,說明Csa3a直接調控這些基因參與獲取過程;Csa3a蛋白還能特異性結合leader序列從而激活CRISPR RNA轉錄。
          綜上所述,本研究揭示了冰島硫化葉菌Ⅰ-A型CRISPR-Cas系統的調控機制,即Csa3a轉錄調控因子既可以調控參與獲取過程的免疫適應基因和DNA修復相關基因,又能激活CRISPR RNA轉錄從而增強對入侵遺傳元件的干涉能力。
        [博士論文] 王嘉博
        畜牧學;動物遺傳育種與繁殖 東北農業大學 2018(學位年度)
        摘要:通過測序以及微芯片技術得到的全基因組基因型數據與表型數據間的關聯分析,是探測人類疾病、農作物性狀未知基因或通過已知群體基因型預測表型數據的方法。根據模型目的可以分為全基因組關聯分析方法(GWAS)和全基因組預測方法(GP)兩類分析方法。
          本研究通過對混合線性模型中隨機效應分子親緣關系矩陣的兩種變形手段,發展兩種全基因組預測方法:1)CBLUP通過參考群體和預測群體個體聚類壓縮成組,利用組間分子親緣關系矩陣代替個體間分子親緣關系矩陣。通過模型似然值函數探測最佳壓縮比例,進行BLUP預測;2)SBLUP通過SUPER方法對參考群體的基因型和表型進行GWAS分析,劃分遺傳關聯區域(bin),通過模型似然值確定bin的大小和最佳的bin數量,利用篩選出來的bin創建針對性狀的獨特分子親緣關系矩陣,最后在混合線性模型中進行預測。通過在模擬數據和真實數據中與GBLUP和貝葉斯LASSO方法進行對比發現,SBLUP對于簡單性狀(控制性狀的基因數目較少)比較敏感,在這一領域具有非常大的優勢,預測準確率相對于其他三種方法提高很大;CBLUP對于遺傳力偏低且控制性狀的基因數據比較多的性狀比較敏感,在這種遺傳背景下的性狀具有比較大的優勢,預測準確率有很好的表現。在真實數據(閩南芥、老鼠和玉米)中一共157個性狀中,這兩種方法只有在其中21個性狀中的預測準確率沒有貝葉斯LASSO高,超過比率達到了86.6%。這兩種方法很好的拓展了BLUP系列方法的優勢范圍,從多角度解釋了分子親緣關系矩陣的構建和混合模型隨機項的多元組建。在方法計算效率測試中,我們使用模擬數據擴增和真實大數據進行測試,結果展示我們的兩種方法均具有較好的計算效率,計算速度比貝葉斯LASSO快,但比GBLUP要慢。結果證明在保證BLUP系列運算速度快的優勢下,提高了模型預測的準確率。為人類疾病預測和動植物育種提供了高效、準確的全基因組預測新方法。
          本研究通過對現行世界廣泛應用的全基因組關聯分析工具軟件(GAPIT)的重新編譯,建立GAPIT第三版本,并在R語言平臺實現在線調用和分析。軟件主要功能包括:1)整合最新GWAS算法包括一般線性模型(GLM)、混合線性模型(MLM)、壓縮式混合線性模型(CMLM)、SUPER、Farm-CPU和多位點混合線性模型(MLMM),使用戶可以在一款軟件中同時進行多方法的分析比較;2)將主體分析軟件拆分為數據邏輯準備、數據質量控制、中間介質運算、統計分析和結果輸出五個部分,這樣的邏輯安排使GAPIT3可以適應第三方軟件調用和輸入,為未來GAPIT線上分析大數據做準備;3)多種基因型和GWAS分析結果輸出,在原有GAPIT基因型和表型關聯分析結果輸出的基礎上,增加了NJtree、3D PCA和染色體顯著位點區域相關性分析等輸出結果,豐富了軟件分析數據的角度和結果展示。本軟件已經開發完畢,現在可以通過www.zzlab.net/GAPIT使用。
          本研究通過對環境與基因型互作模型的開發,設計并完成了一款具有區分加性遺傳效應與互作遺傳效應功能的全基因組關聯分析工具軟件,軟件通過C語言進行編譯,實現了動態內存管理、二位基因型運算、多線程并行處理分析等先進大數據處理技術,對于23G的原始數據,在3個環境下總數據達到207G的情況下,依然僅僅需要4個小時就可以運行完成。同時,通過模擬數據的設置,建立了一套基因與環境模擬方法,利用不同環境下的遺傳相關對整個遺傳效應中加性效應和互作效應的比例進行設定,經過測試我們發現GbyE模型在互作效應占主效的情況下具有十分優越探測能力,具有十分顯著的統計學強度優勢,而在加性效應占主效的情況下統計學強度和純加性效應模型保持一致,并沒有丟掉統計學強度。在真實數據中,我們利用Ames和NAM兩個群體的開花期性狀進行分析,并通過交叉驗證和其他學者的研究結果進行富集驗證,結果展示,在真實數據中GbyE模型具有較好的驗證,以500K為驗證區間的隨機富集驗證率為20%左右,而我們的GbyE達到了顯著的30%,以1M位驗證區間的隨機富集驗證率為30%左右,而我們的GbyE達到了顯著的40%。本軟件已經開發完畢,現在可以通過www.zzlab.net/GbyE使用。
        [碩士論文] 徐嬌
        生物學;遺傳學 南京師范大學 2018(學位年度)
        摘要:黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)作為模式生物在研究先天免疫機制方面起到了重要作用,而Toll通路是果蠅中最重要的先天免疫通路之一,能夠通過一系列信號傳導抵抗革蘭氏陽性菌的入侵。最近的許多研究表明,microRNA(miRNA)在果蠅免疫信號傳遞過程中發揮著重要的調控作用。miRNA是一類廣泛存在于動植物基因組中長約21-24nt的小非編碼RNA,通過結合靶基因mRNA的特定位點,抑制mRNA的翻譯或誘導mRNA的降解,介導多種重要生理活動與過程,在轉錄后水平調控基因的表達。在本實驗室前期的工作中,通過高通量測序的篩選,發現miR-964在果蠅受革蘭氏陽性菌刺激后發生了顯著的下調,據此猜測miR-964可能作為果蠅Toll免疫響應中的重要調控因子。因此,本論文采用實驗生物學和生物信息學有機結合的方法,通過體內、體外實驗證明果蠅miR-964能夠直接靶向抗菌肽基因Drosomycin(Drs)來調控Toll信號通路。本論文所取得的主要實驗研究結果如下:
          1.利用革蘭氏陽性菌糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)分別感染miR-964高表達果蠅、野生型果蠅(w1118)和miR-964基因敲除果蠅,通過生存率分析實驗發現miR-964高表達果蠅的生存率顯著低于野生型果蠅和miR-964基因敲除果蠅的生存率。
          2.通過實時熒光定量(qRT-PCR)實驗檢測野生型果蠅(w1118)在感染革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(Micrococcus luteus,M.luteus)后miR-964基因的表達,并發現感染后24h、48h和72h均有顯著上升;而miR-964高表達果蠅在感染M.luteus24h后Drs表達量顯著下降,miR-964敲除果蠅在感染M.luteus12h和24h后Drs表達量顯著上升。通過構建miR-964表達回復果蠅,并經qRT-PCR和GFP綠色熒光蛋白檢測發現抗菌肽基因Drs的表達量得到了回復。實驗證明,果蠅miR-964能夠響應革蘭氏陽性菌的刺激,并影響Toll通路下游抗菌肽Drs的表達。
          3.為了進一步研究果蠅miR-964影響Toll通路的分子機制,利用TargetScan、miRanda和PITA軟件對miR-964的靶基因進行了預測并取交集,獲取了兩個可能受miR-964調控的Toll信號通路中的相關基因—Spz和Drs。
          4.通過雙熒光素酶報告基因系統對miR-964靶基因進行體外驗證,證明Drs是miR-964的直接靶基因。
          5.在果蠅體內利用qRT-PCR和Western Blotting的方法再次驗證了miR-964和Drs基因的靶標關系,進一步證實miR-964是直接靶向抗菌肽基因Drs的。
          本研究揭示miR-964能通過直接靶向基因Drs的3'UTR調控抗菌肽Drs的表達來對Toll信號通路進行負反饋調節,從而影響果蠅先天性免疫的作用機制,為研究miRNA在先天免疫中的功能提供了新的證據和重要的參考。
        [碩士論文] 郝偉琪
        法醫學 南方醫科大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:單核苷酸多態性(SNP,Single nucleotide polymorphism)是人類基因組中含量最豐富的DNA序列多態性,指的是在基因組中由單個核苷酸的變異(轉換或顛換;插入或缺失)所引起的DNA序列多態性,被認為是繼STR后的第三代遺傳標記。隨著全基因組計劃的完成,越來越的SNP位點被發現,同時人們發現某些SNP位點具有人群特異性,這些位點在不同人群之間基因頻率差異非常大(AIMs,Ancestry informative markers),使用這樣一組祖先信息位點進行人群區分和個體祖先信息的推斷逐漸被人們熟知和運用。篩選和檢測人群間基因頻率差異大的多態性位點即祖先信息位點(AIMs)可以進行人群的遺傳結構分析和個體的種族推斷。本研究旨在建立一種針對五大洲際人群的SNP種族推斷體系,并建立相應的參考數據庫,從而實現對相應人群的遺傳結構的研究,在法醫學中使法醫DNA技術從“STR被動比對”向“SNP主動查找”拓展,為反恐維穩、公共安全提供新型科技手段。
          方法:通過文獻調研,篩選針對五大洲際人群的28個祖先信息位點(AIMs),均為二等位基因,基于較為普及的毛細管電泳儀和SNaPshot檢測分型技術構建單管復合擴增檢測體系,并對本實驗室所收集的來自五大洲際21個人群的998份樣本進行28個SNP位點基因分型的檢測。采用GeneMapper進行電泳圖譜的分型分析,利用相關統計方法對該體系所檢測的樣本分型和從網上數據庫所下載的數據共3090份樣本進行合并分析來探究該體系的區分能力,并利用參考數據庫(不包含有測試人群)對來自12個人群的663份個體來評估該體系的個體祖先推斷能力。
          結果:STRUCTURE聚類分析、群體主成分分析以及系統樹顯示28個祖先信息位點能夠能把所收集的人群分為六部分,其對南亞人群和歐亞混合人群也具有很好的區分能力。針對個體祖先來源推斷中,根據663個測試個體的人群匹配概率(AMP,Assignment Match Probability)顯示,該體系對于五個洲際祖先來源的個體的推斷準確性達到100%,對于南亞及中亞人群的推斷準確率在90%以上。
          結論:該體系能夠準確對五大洲際人群及混合人群(南亞及中亞)進行區分。相對于利用STR對未知DNA樣本來源點對點的被動比對,該體系利用SNP對未知個體的祖先來源的推斷的主動查找為法醫學案件的偵破和家系排查等提供了新的思路、方法和依據。
        [碩士論文] 高輝
        內科學(心血管) 廣西醫科大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:高脂血癥作為傳統的冠心病的危險因素,具有可調節及遺傳的特性。國外全基因組關聯研究證實在歐裔人群中VLDLR rs3780181SNP與血TC和LDL-C水平具有一定相關性。但是不同種族基因變異的效應強度具有一定的差別,國外的研究結果需要在不同種族中進行重復驗證,故研究中國人群VLDLR rs3780181SNP與血脂紊亂等其他代謝性疾病的關系意義重大。京族是中國唯一的從事海洋漁業的少數民族,京族人群飲食習慣、社會習俗以及遺傳背景與內陸民族及當地漢族可能有不同之處,是進行群體遺傳學研究的理想群體。因此本文的研究目的是探討廣西京族人群和當地漢族人群VLDLR rs3780181SNP和環境因素與血脂水平的關系。
          方法:采用分層抽樣的方法,隨機選取廣西東興市江平鎮京族和漢族人群各707人作為研究對象,其中包括276名漢族男性(占漢族總受試者人數的39.0%)、431名漢族女性(占漢族總受試者人數的61.0%)以及278名京族男性(占京族總受試者人數的39.3%)、429名京族女性(占京族總受試者人數的60.7%)。采取血液標本分別用于測定血脂水平和血DNA提取。利用PCR-RFLP聯合PCR產物基因測序驗證的技術路線方法對VLDLR rs3780181SNP進行基因分型。利用spss17.0軟件進行后續的數據分析基因型與血脂水平的關系。
          結果:(1)京族組體重、身高、腰圍、體重指數、血糖水平高于漢族,京族人群的ApoA1/ApoB比值、TC、TG、飲酒比率低于當地漢族。(2)京族人群的VLDLR rs3780181SNP最小G等位基因頻率低于漢族人群(8.3%vs10.5%,P<0.05),在京族人群中,男女性別間rs3780181SNPAA、AG、GG各基因型的分布比較差異有統計學意義。(3)通過協方差分析不同VLDLR rs3780181SNP基因型與血脂水平的關系,我們研究發現AG/GG基因型京族人比AA基因型京族人血TC水平低,AG/GG基因型的漢族人比AA基因型漢族人血LDL-C水平低。當按性別亞層進一步分析時發現,以上這種差異分別只存在于各自的女性亞組人群中,不表現在男性人群中。另外我們發現只有漢族女性的AG/GG基因型者血ApoB水平比AA基因型低(均P<0.05)。(4)多重線性回歸分析結果顯示兩民族合并人群的血清LDL-C和TC水平、漢族組的血清LDL-C水平和京族組的血清TC水平與VLDLR rs3780181SNP基因型呈顯著相關(均P<0.05)。當兩民族人群進一步按性別分層分析發現僅京族女性組的血清TC、漢族女性組的血清LDL-C、ApoB水平與VLDLR rs3780181SNP基因型呈顯著相關(P<0.05);(5)兩民族人群及不同性別亞組的血脂相關指標也不同程度的與多種環境因素和其他因素相關,如性別、年齡、體重指數、吸煙、飲酒、血壓、脈壓、血糖、腰圍等。
          結論:廣西京族與當地漢族人群間VLDLR rs3780181SNP與血脂水平的關系存在差異,兩組人群不同性別中該位點與血脂水平的關系也有差異。提示廣西京族與漢族人群中VLDLR rs3780181SNP與血脂水平的關系可能存在種族和/或性別特異性。
        [碩士論文] 任碧玉
        生物學 安徽大學 2018(學位年度)
        摘要:Sonic Hedgehog(Shh)信號在調控神經管腹側神經元的分化中起著關鍵作用。RNF220編碼一個泛素連接酶,在中后腦與脊髓的腹側區域表達,通過調控Shh信號通路轉錄因子Gli的活性參與腹側神經管的圖式形成。RNF220在腹側神經管特異表達的轉錄調控機制,特別是其自身的表達是否受到Shh信號的調控尚不清楚。本論文解析了RNF220基因的潛在增強子元件,并以雞胚為模型,通過報告基因系統,驗證了其中一個超級保守元件M280在神經管中具有轉錄激活活性,還發現在雞胚神經管中激活Shh信號活性會激活RNF220的異位表達。作為一個泛素連接酶,RNF220自身的蛋白穩定性是否受到泛素化修飾的影響及其調控機制也是一個重要問題。本文發現,RNF220是泛素連接酶Smurf1/2的靶蛋白,Smurf可結合RNF220并誘導其泛素化與降解。論文還發現鋅指蛋白ZC4H2可抑制Smurf對RNF220的泛素化而提高其穩定性。本文初步揭示了RNF220基因的轉錄水平和蛋白翻譯后修飾水平的調控機制。
        [碩士論文] 蔣洋洋
        生物醫學工程 南方醫科大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:
          小鼠作為一種在醫學研究中被廣泛使用到的模型生物,在生命科學和生物醫藥相關領域的研究中發揮著重要的作用。大量生物醫學研究者用小鼠建立人類疾病的模型,尤其是許多腫瘤模型,利用小鼠研究人類疾病發病機制、發現治療藥物、評估藥效與副作用。但是,在許多情況下人類疾病的小鼠模型展示出與人類疾病不同的特性,包括對藥物的不同反應。據報道,根據小鼠模型開發的腫瘤治療藥物僅有約5%在人類具有安全而肯定的療效。因此,正確構造和合理解釋人類疾病的小鼠模型是一個重要問題。
          最近的基因組研究揭示不僅在人類與小鼠而且在所有哺乳動物中都存在大量長鏈非編碼RNA(簡稱lncRNA)基因,并揭示基因組修飾對基因表達具有重要的調控作用。研究已揭示基因組修飾的一般機制,即DNA和組蛋白修飾酶由lncRNA攜帶到特定基因組位點。這些新發現促使研究者從表觀遺傳學角度研究基因表達的種系差異。由于表觀基因組修飾由大量lncRNA介導,兩個亟待解答的問題是:(1)在人類和小鼠的lncRNA中有多少屬于保守的直系同源物,另外又有多少lncRNA具有物種特異性?(2)是否保守的直系同源lncRNA如同保守的蛋白質編碼基因那樣也具有保守的功能?這兩個問題對于當前對lncRNA的研究現狀來說是極具研究意義和價值的。
          方法:
          首先,根據GENCODE項目首批鑒定的13562個人類lncRNA,從本課題組前期建立的同源數據庫——LongMan數據庫中搜索每個lncRNA在小鼠基因組同源區域的同源序列。然后人類lncRNA在小鼠的同源序列和GENCODE項目首批鑒定的10481個小鼠lncRNA經過較嚴格的判定條件,確定人類與小鼠的直系同源lncRNA基因。第二,使用本課題組前期開發的生物信息學工具——LongTarget預測部分人類與小鼠直系同源lncRNA在其局部基因組區域的DNA結合域與結合位點。第三,使用MEGA7計算由LongTarget預測出的同源lncRNA在其局部基因組區域的DNA結合域的遺傳距離。最后在同源lncRNA在基因組局部區域的DNA結合位點分布中,通過GO分析和DAVID功能注釋工具對部分同源lncRNA啟動子區的靶蛋白質編碼基因進行功能分析。
          結果:
          根據較嚴格的判定條件,僅有54個lncRNA基因在人類和小鼠是直系同源基因。其次,即便是這些直系同源lncRNA在人類與小鼠基因組也有許多種系特異性的DNA結合位點并且保守的直系同源lncRNA也存在不同的DNA結合域。第三,若干靶基因的功能注釋提示種系特異性的表觀基因組修飾可能對人類和小鼠的表型差異有重要影響。
          結論:
          人類與小鼠僅有極少量直系同源lncRNA,且這些lncRNA有種系特異性的DNA結合位點,提示人類和小鼠蛋白質編碼基因接受非常不同的表觀遺傳學調控,并在很大程度解釋了為何許多人類疾病的小鼠模型不能準確模擬人類疾病。
        [碩士論文] 高程杰
        細胞生物學 鄭州大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:紅系發育是造血干細胞經增值、分化最終生成成熟紅細胞的過程,受到轉錄因子的協同調控。紅系發育過程可分為三個階段:早期紅細胞生成、終末分化、網織紅細胞的成熟。紅系發育過程不僅有細胞體積逐漸較小、染色質凝集及血紅蛋白增多等細胞形態變化,且各基因的表達水平也隨之變化。轉錄因子及其調控基因存在復雜的相互作用,也存在階段變化的特征。為了研究紅系發育中系統的轉錄調控,深入理解紅系發育早期和終末階段的差異,本課題基于RNA-seq數據構建紅系發育過程的基因共表達網絡,并通過網絡模塊探索紅系發育早期和終末階段的調控網絡及關鍵基因差異,加深對紅系發育調控機制的理解。
          方法:基于本課題組臍帶血和外周血體外分化、發育的各階段RNA-seq測序數據,使用FastQC、tophat、cuffquant、cuffdiff、cummeRbund轉錄組數據處理流程,得到各階段基因表達數據及差異基因;對基因表達數據進行過濾后通過WGCNAR軟件包構建基因共表達網絡,并使用pajek軟件計算度、k-核、介數、緊密度等網絡結構參數,分別對網絡及各模塊進行分析,比較早期模塊與終末模塊的調控差異。
          結果:WGCNA構建得到的基因共表達網絡,進行網絡分析,得到紅系發育共表達網絡的核心基因,其中30%左右已在文獻中得到驗證。共表達網絡模塊分析得到了4個階段特異模塊;1個早期祖細胞模塊和3個終末階段晚期模塊。早期祖細胞模塊中核心基因包括PTPN6、ETS2等已知紅系相關基因,參與細胞增值、分化和凋亡相關通路,與早期祖細胞的增值、分化相關。兩個終末階段晚期模塊由不同基因組成但具相似的功能,調控自噬、蛋白質修飾、泛素化介導的生物學過程等,與紅細胞的成熟及細胞骨架的重排有關,已知紅系相關基因如ULK1、AKT2、EIF4EBP2和FOXO3。終末階段晚期模塊3中核心基因包括TAL1、NFE2等已知紅系關鍵基因,參與調控染色質組成、去磷酸化等過程,與晚期胞內染色質變化及紅系發育過程的順利進行有關。
          結論:紅系發育基因共表達網絡及其網絡分析結果表明早期祖細胞模塊核心基因集中在祖細胞增值和分化,終末晚期模塊集中在自噬、染色質凝集、細胞骨架重排等與脫核相關的功能等,與已知紅系發育表型及功能一致。這不僅能加深對紅系發育早期祖細胞增值和終末脫核中已知關鍵基因調控通路的理解,也可以預測新關鍵基因,為體外產生功能紅細胞提供幫助。
        [碩士論文] 吉杰
        臨床檢驗診斷學 大連醫科大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:
          1.采用McSNP法對位于人FOXO3A非編碼區SNP位點分型。
          2.制作FOXO3A及GAPDH內參基因的質粒標準品,構建可長期、間斷性地對大量臨床來源樣本進行FOXO3A基因表達的定量檢測體系。
          3.分析SNP型對FOXO3A基因表達水平的影響。
          方法:
          1.分離14位健康獻血者的單個核細胞(PBMC),從中提取基因組DNA及總RNA。
          2.McSNP分型方法的建立。首先設計包含SNP位點的特異性PCR擴增引物,應用該引物進行PCR反應,然后用限制性內切酶切割PCR產物,最后應用熔解曲線方法分析酶切產物,確定SNP型。應用PCR-限制性核酸多態性分析(PCR-RFLP)及PCR產物測序法對分型結果進行驗證。
          3.FOXO3A基因表達定量體系的建立。采用TA克隆的方法構建pGMT-FOXO3A、pGMT-GAPDH重組質粒,獲得定量標準品,使用該標準品制作定量標準曲線。設計用于FOXO3A基因表達定量的特異性擴增引物,對標準品進行多次重復定量檢測,計算定量結果的精密度與偏倚,評價定量體系的可檢測范圍。
          4.對10份來源于健康獻血者的DNA及RNA樣本進行rs4946936分型和FOXO3A基因表達定量。應用統計學軟件SPSS做獨立樣本T檢驗,比較組間的基因表達水平差異。
          結果:
          1.14位獻血者rs4946936的McSNP分型結果及5位獻血者rs2802288的McSNP分型結果均與RFLP分型法所得結果一致,PCR產物測序也驗證了上述分型結果的準確性。McSNP分型法中rs4946936為TT型樣本的熔解曲線顯示為Tm值為77.25℃的單峰,TC型顯示為Tm值為77.25℃和71.75℃的雙峰,CC型顯示為Tm值為71.25℃單峰。
          2.TA克隆藍白斑篩選實驗顯示質粒連接、轉化成功,對陽性克隆采用PCR法鑒定,顯示質粒中含有目的片段。將質粒作為標準品梯度稀釋制作定量標準曲線,擴增效率在0.9-1.1之間,相關系數>98%,FOXO3A定量結果顯示樣本基因表達水平在1.56×106-1.56×103copies/μl(Ct值20~30)范圍內精密度變異系數小于5%,偏倚小于7.5%。
          3.10位獻血者rs4946936McSNP分型結果顯示6個樣本為CC型,3個樣本為TC型,1個樣本為TT型。rs4946936T突變型組(TT和TC型)與CC型組相比,FOXO3A基因表達水平未見統計學差異,p>0.05。
          結論:
          1.成功建立了基于熔解曲線分析的McSNP分型方法。
          2.構建了可長期對間斷來源樣本的FOXO3A基因表達量進行比較的檢測體系。
          3.對10份獻血者的基因表達水平分析,未見不同rs4946936型別個體間FOXO3A基因表達水平具有明顯差異。
        [碩士論文] 周濤
        生物學 浙江理工大學 2017(學位年度)
        摘要:基因組島是由水平轉移基因與移動元件等構成的基因簇,可以通過轉導、結合、轉化等方式進入細菌中。基因組島具有獨特的組分和功能特點,常常攜帶一些與微生物進化和環境適應性相關的功能基因,如致病性和抗生素耐藥性基因。因此,基因組島的識別分析已經成為微生物功能基因組研究中的一項重要研究課題之一。本文重點圍繞基因組島的識別與分析,構建了基因組島的數據庫,搭建了基因組島的在線識別與分析平臺。其主要內容安排如下:
          1.整理了基因組島的相關數據。重點介紹了現有的基因組島數據庫和現有的識別算法;系統地整理了基因組數據,利用基因組島識別方法,獲得了現有基因組的預測結果,按照從UniProt數據庫中獲取基因注釋的流程,整理了預測基因組島中的基因注釋數據。
          2.構建了基因組島的數據庫。根據基因組島的數據類型,分析了內容之間的關聯,利用關系型數據庫設計了基因組島數據的存儲模型;由于基因組島數據的特殊性,利用冗余備份和水平分解的方法,優化了數據庫的訪問效率;針對數據庫的擴展性問題,本文提出了相應的解決方案。
          3.搭建了基因組島的識別與分析平臺。根據基因組島的展示內容,采用了分層展示策略,設計了基因組島數據的展示方案;比較了幾種常用的基因組島可視化的圖形格式,選取了SVG作為展示圖形的格式生成圖形,實現了基因組島數據的可視化,從而克服了由位圖難于實現而引起的交互問題;根據現有的基因組島識別方法的特點,系統整合了識別算法,搭建了基因組島的識別平臺;針對科研人員的需求,本文對基因組島數據庫以及識別分析平臺進行了Web發布,實現了基因組島數據的在線瀏覽、在線識別和在線分析。
        [博士論文] 梁燕
        生物化學與分子生物學 內蒙古大學 2017(學位年度)
        摘要:基因組穩定性對于維持正常細胞周期至關重要,能夠確保每次細胞分裂后,其兩個子細胞得到完整無突變的一套基因組,保證遺傳的穩定性。dnaM(原ybfE在此依據其功能被命名為dnaM)基因及其產物的功能尚不清楚,本文發現缺失dnaM基因并不導致細胞死亡,說明該基因是非必須基因。當敲除dnaM基因或過表達DnaM蛋白會導致細胞染色體復制異常,即染色體復制起始非同步和染色體復制不完整。的確,dnaM缺失會提高細胞自發突變率和SOS基因uvrB表達,且對UV敏感,UV照射也會提升dnaM基因表達,這些結果說明dnaM基因產物(DnaM)參與維持基因組穩定性。利用熒光顯微鏡觀察DnaM的亞細胞定位發現,在快速生長的細胞中DnaM與染色體共定位;進一步分析發現DnaM在染色體復制階段(細胞周期C期)與染色體共定位。純化的DnaM-His蛋白質能夠降解線性雙鏈DNA、線性單鏈DNA,還改變質粒DNA的超螺旋狀態,結果說明DnaM具有外切酶活性并可能具有拓撲酶活性。利用DnaM消化3'biotin標記的DNA發現,DnaM從3'端消化DNA,具有3'→5'外切酶活性。進一步實驗顯示DnaM切割閉合雙鏈DNA中一條鏈而松弛處于超螺旋狀態的質粒DNA。為了確定DnaM的功能位點,分析其氨基酸序列后對19個堿性氨基酸位點分別進行了突變,而后通過流式細胞儀檢測不同突變蛋白對細胞染色體復制的影響。結果發現:DnaMK38I、DnaMKK51E、DnaMR52G、DnaMK56E和DnaMa76G五個突變蛋白的功能有明顯改變,不再影響染色體復制,說明這些位點的氨基酸對DnaM的功能至關重要;而DnaMR92G突變蛋白的功能有所增強。有趣的是,DnaMK51E不再與染色體共定位,DnaMR92G仍與染色體共定位,說明DnaM是通過與染色體共定位來發揮作用的。經過純化DnaMK51E和DnaMR92G突變蛋白,并與質粒DNA孵育發現,DnaMK51E和DnaMR92G突變蛋白對降解DNA的能力均有不同程度下降,但提升其松弛超螺旋DNA的活性,說明這兩個氨基酸位點對于保持DnaM功能完整性是必要的。為了探究DnaM是如何定位于染色體并發揮作用,通過細菌雙雜交檢測了DnaM與DNA解旋酶DnaB、滑動夾子DnaN(sliding clamp)及DNA聚合酶Ⅲ的一個亞基DnaX的相互作用,結果發現DnaM與DnaN有相互作用,說明DnaM通過與DnaN的相互作用來與正在復制的染色體共定位。
          綜上所述,DnaM在復制階段定位于染色體并利用其3'外切酶和可能的拓撲酶活性來糾正復制錯誤和減輕拓撲壓力,是確保基因組穩定性的輔助機制。染色體復制過程中,由DNA解旋酶在復制叉前解開雙鏈DNA,所形成的復制叉前超螺旋DNA由拓撲酶松弛,以此緩解解旋酶引入的拓撲壓力。DnaN形成二聚體的滑行夾子,使DNA聚合酶Ⅲ錨定在DNA模版上,確保染色體復制的連續性,復制結束后滑行夾子釋放DNA聚合酶Ⅲ,并脫離DNA模版。因此,DnaM在復制過程中,通過與DnaN的相互作用也定位于復制叉,并從3'末端把新合成的錯誤脫氧核苷酸切下來,幫助DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性以保證復制正確性;同時,DnaM可能具有的拓撲酶活性輔助拓撲酶松弛超螺旋DNA,確保復制叉的順利前行。
        [博士論文] 魏青
        發育生物學 西北農林科技大學 2017(學位年度)
        摘要:體外培養的胚胎干細胞具有無限增殖、自我更新和多能性的特點。這些特點不僅為干細胞體外發育和分化提供了研究模型,也為再生醫學和損傷性疾病治療提供了希望。然而,體外培養的胚胎干細胞很容易受到各種環境因素影響,從而喪失自我更新的能力,這嚴重影響了胚胎干細胞的臨床應用。SC1作為一種RasGAP和Erk1/2蛋白的雙重抑制劑,已被證實在小鼠胚胎干細胞的自我更新中發揮重要作用。在無LIF、血清和飼養層的條件下,加入SC1能夠有效的維持胚胎干細胞的自我更新。自SC1發現以來,雖然已有一些研究報道了SC1的功能,但其發揮作用的深層分子機理仍未見報道。為此,本研究采用基因表達譜芯片、小RNA深度測序、免疫染色、Western blot等方法,全面檢測了SC1處理后小鼠胚胎干細胞等的基因和蛋白表達影響,并深入探究了SC1維持胚胎干細胞自我更新的分子機理。主要研究結果如下:
          1. SC1處理(6h)可以顯著提高小鼠胚胎干細胞和F9細胞中多能性因子的表達水平。AP染色實驗發現SC1處理可以顯著提高小鼠胚胎干細胞和F9細胞的堿性磷酸酶活性。說明SC1在維持小鼠干細胞多能性上發揮重要作用。
          2. SC1拮抗維甲酸(Retinoic acid, RA)誘導的細胞分化。RA可以誘導胚胎干細胞和F9細胞的分化,顯著下調多能性基因Nanog,Oct4,Sox2和Klf4的表達。在RA誘導F9細胞分化過程中添加SC1,能夠顯著改變F9細胞的形態,形成“克隆樣生長”。這暗示SC1可以抑制RA誘導的F9細胞分化。
          3. SC1拮抗RA誘導分化的分子機理。與單獨添加RA相比,在F9xibaozhong同時添加SC1和RA6 h后,多能性因子Nanog,Oct4和Klf4的表達顯著上調;同時添加SC1和RA24h后,Klf4的表達繼續顯著增加,而Nanog和Oct4的表達則無顯著變化。此外,通過Western blot檢測發現,同時添加SC1和RA時可顯著抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,并且隨著添加SC1作用時間和濃度的增加,Erk1/2蛋白磷酸化的抑制效果愈加顯著。由此可見,SC1是通過增加Klf4的表達和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,進而抑制RA誘導F9細胞的分化。
          SC1抑制RA誘導分化過程中影響F9細胞整體甲基化水平。免疫熒光染色結果顯示,單獨添加SC1和同時添加SC1和RA均可以顯著下調F9細胞的整體DNA甲基化水平。單獨添加SC1不影響F9細胞整體DNA羥甲基化水平,但同時添加SC1和RA可顯著上調細胞整體DNA羥甲基化水平。在RA誘導分化的F9細胞中,添加SC1引起的DNA甲基化水平的變化,可能也是其能夠拮抗RA誘導分化的原因之一。
          4.利用全基因組表達譜芯片分析了SC1處理(6h)對小鼠J1胚胎干細胞基因表達的影響。與加入等體積DMSO的J1胚胎干細胞相比,SC1處理顯著上調248個基因表達,顯著下調212個基因的表達(FC≥2,P≤0.01)。KEGG通路分析顯示這些差異表達基因主要富集在PI3K-Akt通路,Ras信號通路,干細胞多能性調節信號通路以及細胞粘附等代謝通路。
          5.利用小RNA深度測序分析了SC1處理(6h)對小鼠J1胚胎干細胞中miRNAs表達的影響。結果顯示SC1處理能顯著上調14個miRNAs,顯著下調176個miRNAs的表達(FC≥1.5,P≤0.05)。在J1細胞中過表達顯著上調表達的miR124-3p,可以顯著促進Nanog蛋白的表達,下調Erk1和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化。通路報告實驗發現miR124-3p能顯著抑制MEK/ERK通路。進一步的qPCR、Western blot和雙熒光素酶報告實驗證實了miR124-3p可通過靶向Grb2,Sos2和Egr1來高效抑制MEK/ERK通路。因此,SC1可以通過上調miR124-3p的表達來協助其有效抑制MEK/ERK通路。
          6.研究分析SC1處理對細胞形態的影響。促進細胞聚集有利于胚胎干細胞維持自我更新,SC1能顯著促進細胞形成克隆樣結構。糖原染色實驗發現SC1處理糖蛋白總量顯著增加,這暗示SC1能促進細胞粘附分子表達量增加。qPCR和Western blot檢測證明, SC1處理可顯著上調F9細胞中細胞粘附分子E-cadherin和Alcam的表達。然而單獨過表達粘附分子Alcam并不能顯著改變細胞形態。此外,蛋白合成抑制實驗證明SC1主要是通過提高細胞粘附分子的表達來促進細胞形成克隆樣結構。
          綜上所述,SC1能通過有效抑制分化相關的MEK/ERK通路,以及增強細胞之間粘附來維持干細胞自我更新的能力。
        [碩士論文] 葉露
        軟件工程 北京化工大學 2017(學位年度)
        摘要:隨著高通量測序技術的快速發展,出現了很多應用高通量測序數據的結構變異檢測方法。由于高通量測序本身的局限性,例如片段較短、測序誤差偏大等因素,常規的檢測方法存在較大的局限性,檢測精度和敏感度不夠。針對這個問題,本文主要針對插入變異,提出了一種基于序列拼接的基因組插入變異集成檢測方法,取名為ISALins。本文的主要內容如下:
          (1)設計基因組插入變異檢測流程,分析了檢測流程用到的實驗數據。鑒于千人基因組發布的插入變異數量太少,本文通過編程實現生成實驗要用到的插入變異標準集。為了全面驗證實驗的檢測效果,根據實驗需求準備了NA12878個體真實測序數據和變異基準數據,仿真數據和真實數據為本課題奠定了數據基礎。
          (2)分析了插入變異的片段特征,提出了一個聚簇支持插入變異片段的聚簇算法,保證了后續序列拼接和變異檢測的有效性。同時提出一種解決基于De Brujin圖序列拼接算法中重復序列的有效策略。
          (3)提出了一種基于序列拼接的插入變異集成檢測策略,在仿真數據和真實數據上分別進行了實驗。該策略的實施分為四個階段:第一階段,為了在保證檢測敏感度的情況下,提高長插入變異的檢測精度,通過融合多個工具的檢測結果得到一個初始插入變異可疑斷點集合;第二階段,通過在每個可疑斷點附近聚簇OEA片段,并進行軟切片段(soft-clipped read)分析來得到高質量軟切片段;第三階段,利用基于De Brujin圖的方法來進行局部拼接,通過使動態k-mer和k-mer頻率分析策略來消除基因組重復序列造成的錯誤拼接問題。第四階段,通過將重疊群片段contigs使用比對工具bwa和blat和參考基因比對后進行插入變異檢測。實驗結果表明,相對于傳統的插入變異檢測方法,本文所提出的策略對高覆蓋度和低覆蓋度測序數據的變異檢測效果良好,在一定程度上提高了結構變異檢測精度。
        [博士論文] 孟虎
        生物學 內蒙古大學 2017(學位年度)
        摘要:核小體是真核生物染色質結構的重要組成單元,涉及到與DNA相關的各個生物學功能,如DNA的轉錄調控、復制與修復。核小體的精確定位是核小體行使其生物學功能的關鍵,核小體定位受到諸多因素的影響,諸如染色質重塑因子、DNA結合蛋白、核小體對DNA序列使用的偏好性等。隨著染色質免疫共沉淀技術與芯片的結合(ChIP-chip)、染色質免疫共沉淀技術與第二代測序技術的結合(ChIP-seq)技術的發展,目前已經獲得了多個物種精確的核小體定位圖譜。核小體的結構在所有的真核生物中是保守的,一個核小體單位一般是由一段長為147bp的核心DNA序列纏繞在組蛋白八聚體上形成的,且組蛋白八聚體的結構在不同物種中也是保守的。不過不同物種的基因組組成背景是存在差異的,序列偏好又是決定核小體定位的重要因素之一,而核小體的核心定位序列是否像基因組序列一樣存在協同進化還不清楚。另外,核小體的特異性分布重要集中在基因的轉了起始區域,轉錄起始位點周圍核小體的特性也是研究的熱點,但是如何定義±1核小體以及在理論上找出可靠的NFR區域是需要仔細研究的,同時TSS上下游核小體的分布特征、NFR的序列結構與基因表達水平的關系也待進一步討論。依賴于核小體的轉錄調控機制是十分復雜的,核小體參與的基因轉錄調控網絡還需不斷完善。因此,本文基于釀酒酵母、裂殖酵母、果蠅的單堿基精度的核小體定位圖譜從三個方面進行了探討,首先,對三個物種的核小體核心序列完成了核小體序列使用做了進化分析;其次,以釀酒酵母為樣本,系統分析了其基因周圍核小體的分布特征及其與基因表達之間的關系;最后,通過三個物種基因周圍的±1核小體序列特征的分析,探討了不同物種中基于核小體的基因表達調控機制的差異。
          (1)在核小體序列使用的進化分析中,通過新對稱相對熵及序列模體使用特征參數的方法對釀酒酵母、裂殖酵母、果蠅的核心核小體序列做了分析。通過比較不同物種中不同k-mer信息所產生的新對稱信息熵,結果顯示,不同物種核小體的序列使用是存在差異的,而這些差異主要體現在核小體序列的中心區域附近,單堿基(1-mer)對核小體序列的序結構特征做出了主要的貢獻,核小體對于序列的依賴強度為:果蠅>裂殖酵母>釀酒酵母。新對稱信息熵對于不同物種中核小體序列的分析證明了核小體序列使用也是存在協同進化關系的。對于核小體序列堿基使用的分析發現,無論在哪個生物中,其核小體核心序列中都存在兩個特殊的位點:一個位點富含堿基A缺少堿基T,另一個恰恰相反,富含堿基T缺少堿基A。進一步的研究發現,新對稱信息熵的熵值分布峰的形成是由堿基A、T的使用差異造成的,而熵值的高低與k-mer中堿基A、T的含量具有很好的相關性,這在三個物種中也是極為保守的。為了進一步分析核小體序列的模體使用差異,我們使用分別基于CG0、CG1和CG2構建的序列模體特征參數對三個物種的核小體序列進行了分析,結果顯示,CG1的模體是構成核小體序列的骨架,這類模體的使用在各個物種的核小體中是相對穩定且保守的;CG0和CG2是調節核小體特征的因素,核小體序列的模體使用差異來源于這兩類模體。
          (2)在基因轉錄起始位點周圍核小體的分布特征研究中,基于釀酒酵母全基因組單堿基精度的核小體定位圖譜,以TSS和TTS為參考位置定義±1核小體,統計核小體的位置分布。結果顯示相對于隨機位置周圍核小體的分布,TSS下游核小體的位置具有顯著的保守性,呈明顯雙峰分布,在TSS上游和TTS兩側核小體的位置分布與隨機位點兩側的核小體位置分布基本相同,對TSS兩側的核小體位置分布進一步分析,按照±1核小體距TSS的遠近可將核小體分布分為兩種固定模式。不過這種核小體位置的劃分方式并不能給出明確的NFR。而后,我們對±1核小體進行重定義,將占據在TSS上或距TSS最近的核小體定義為+1核小體,并分析了核小體的位置分布。結果顯示核小體位置均呈現單峰分布,同時發現核小體分布同樣可以分為兩種模式:具有明顯NFR的核小體分布及無明顯NFR的核小體分布。在具有明顯NFR的核小體分布中,討論了TSS位點與NFR之間的位置關系,NFR中心一般位于TSS上游50-150bp的范圍內,使用D2值的方法分析了NFR的序列特征,發現NFR序列相對于其它核小體間的連接序列具有更強的序結構。最后研究了具有明顯NFR基因的基因表達水平與核小體位置分布及NFR序結構的相關性,發現NFR下游隨著基因表達水平的提高核小體的位置更為保守,NFR上游核小體的位置更為自由,且基因表達水平與NFR區域的長度及其序結構的強度呈正相關。
          (3)在基于核小體的轉錄表達調控機制的研究中,首先通過新對稱相對熵的方法對釀酒酵母、裂殖酵母、果蠅基因周圍的核小體序列做了分析。結果顯示,酉良酒酵母±1核小體的序列特征是有別于其他兩個物種的,這種差異主要體現在兩個方面:①釀酒酵母±1核小體在靠近TSS的一側具有很高的熵值,而其他兩個物種±1核小體不具有這種特征。②裂殖酵母和果蠅的±1核小體熵值分布的峰仍是由堿基A、T的使用差異造成的,而釀酒酵母±1核小體熵值分布的峰也摻雜了堿基C、G使用差異的因素。通過序列模體使用特征參數的方法對±1核小體序列的分析,結果顯示,釀酒酵母基于核小體的轉錄調控機制同樣有別于其他兩個物種,裂殖酵母和果蠅趨向于多核小體共同參與轉錄調控,而在釀酒酵母中更趨向于通過±1核小體的滑動來調控基因轉錄。通過對釀酒酵母中具有不同長度核小體缺失區域的基因及不同表達水平基因的±1核小體的分析,CG0模體信息構建的核小體序列模體使用特征參數分布可以很好的反映出核小體的序列勢能差,而這種序列勢能差又可以很好的反映出核小體的滑動趨勢。
        [博士論文] 馮振興
        生物學 內蒙古大學 2017(學位年度)
        摘要:真核細胞中,基因表達精準的時間和空間調控對于不同生物學進程尤為關鍵。其中,眾多的DNA反應活動受到不同順式調控元件的協同調控,如轉錄啟動子、增強子和絕緣子等。由于染色質折疊,空間染色質結構使得增強子能夠在三維空間中作用于距離自身數十甚至上百Kb堿基的靶啟動子并調控相關基因的表達。增強子-啟動子相互作用在組織特異性基因表達調控中起關鍵作用并可能導致人類相關疾病的發生。近年來,大量高通量染色體構象捕獲技術的發展使人們深入研究這些相互作用成為可能,比如:染色體構象捕獲(3C),4C(circular3C),5C(3C-carboncopy),Hi-C(3C variant)和ChIA-PET。與此同時,隨著各種高通量測序技術的發展,各個實驗平臺產生了大量基因組信號的深測序文件,這些組學數據使人們在不同的基因組范圍內研究遠程相互作用和不同類基因組信號之間的調控關系成為可能。
          本文開發了新的計算方法并用來識別人類四個細胞系GM12878,H1-hESC,HeLa-S3和K562中遠程增強子-啟動子相互作用。我們不僅發現了許多潛在的影響遠程互作用識別的重要基因組信號,還分析了它們的位置,分布,關聯等屬性。最后,我們通過多種模型研究了組蛋白修飾,轉錄因子,增強子RNA,DNA甲基化等多種基因組信號與遠端增強子靶基因的表達調控關系,并在遠端增強子調控靶基因的機制中發現了組蛋白修飾,轉錄因子等不同類基因組信號對應不同的調控特點。論文主要的研究內容概括如下:
          一、基于前人構建的5C技術數據庫,我們從不同類別的信號中提取增強子,啟動子,loop區域的對應特征,比如轉錄因子,組蛋白修飾,DNA甲基化,增強子RNA,核小體位置,染色質狀態,拓撲關聯域等等。然后組合上述特征,提出BRCFS特征選擇方法和隨機森林分類器在人類四個細胞系中預測遠程增強子-啟動子相互作用。和Roy等的結果比較,我們的10折交叉檢驗AUPR精度提高了11%-16%,獨立檢驗的AUPR精度提高了4%-8%。通過分析識別中的特征重要性,我們發現了很多潛在特征的重要作用,比如:增強子RNA,核小體位置等。并且我們發現loop區域的特征對遠程互作用的識別起著很大的作用;另外,不同類信號對于遠程互作用的識別具有調控區域特異性和細胞系特異性。最后我們發現這些重要的特征在正負集樣本中有很大的分布差異。
          二、考慮到遠程增強子-啟動子相互作用受到不同基因組信號,序列元件以及DNA空間結構等多方面協同作用;我們整合轉錄因子,組蛋白修飾,DNA甲基化,增強子RNA,核小體位置,DNA結構屬性,轉錄因子結合模體等信號特征,開發了一種更加高效的方法去預測增強子-啟動子相互作用。基于增強子,啟動子,loop區域的組合特征,我們使用隨機森林和梯度提升算法在人類細胞系中對增強子-啟動子相互作用進行了有效的預測。基于同樣的數據庫,與Roy等的結果比較,我們在同一個細胞系中10折交叉檢驗結果提高了15%-24%;在新的細胞系中獨立檢驗的結果提高了9%-14%。期間,我們綜合學習了不同類型重要特征的貢獻特點,并進一步發現了DNA結構屬性,轉錄因子結合模體對于遠程相互作用識別的重要貢獻。我們對重要的基因組信號特征做了偏相關網絡模型分析,并發現了它們之間重要的關聯屬性。
          三、在人類四個細胞系中,我們使用多種回歸模型研究了增強子靶基因表達水平與不同基因組信號的關系,這些信號包括11種組蛋白修飾,大于120種轉錄因子,染色質可及性,增強子RNA,DNA甲基化和核小體位置。通過結果分析,我們發現基因表達的預測值和觀測值之間有很強的關聯性。然而,有增強子調控的基因樣本集的關聯系數比無調控的基因樣本集要高很多,說明遠程增強子會協同多類基因組信號促進相關基因的表達。
          四、通過分析不同信號對遠端增強子靶基因表達水平的貢獻能力,我們發現遠端增強子調控的基因中,轉錄因子在增強子和啟動子區域對基因表達水平具有較強的影響;而組蛋白修飾在啟動子和loop調控區域對基因表達水平具有較強的影響。對比同一個細胞系正負數據集中不同信號特征的重要性分值變化,我們發現很多組蛋白修飾和部分特異性的轉錄因子發生了很大的變化,說明這些特征協同遠程增強子促進基因表達。
        [碩士論文] 張昌建
        生物物理學 電子科技大學 2017(學位年度)
        摘要:核小體是真核生物體內由 DNA和組蛋白八聚體形成的染色體基本結構單位。基因調控、DNA復制和修復、細胞核內染色質的高級空間結構的形成等生物學過程都依賴于核小體在基因組中的分布與排列。而隨著測序技術飛速發展導致的基因組大數據時代的到來,如何建立快速、有效的識別核小體精確定位算法成為了生物信息學新的挑戰。目前,關于核小體定位理論預測的方法都存在一些缺點,例如數據存在冗余性、核小體特征提取的不全面、沒有友好的免費服務界面等,這驅使我們開發了一個基于核小體序列的結構屬性和長程關聯信息的新的預測方法,彌補了目前關于核小體定位方法的一些缺陷。我們還將該方法擴展到了人類復制起始位點的理論預測上,同樣取得了很好的效果。
          本文分別提取了核小體和復制起始位點序列的核苷酸頻率特征以及包含偽核苷酸組分的物化性質特征,然后通過支持向量機和隨機森林算法分別構建了核小體位點和復制起始位點的預測模型并且利用不同的分類算法作為對照綜合評估了模型的性能;同時,我們開發了免費的在線預測服務軟件供科研人員使用;最后利用核小體的預測模型分析了人類復制起始位點鄰近區域的核小體分布情況。
          我們首先從相關的文獻和數據庫中得到人類核小體和復制起始位點序列的數據,通過對數據的篩選和去相似性處理后,利用偽核苷酸組分提取特征的方法分別對核小體和復制起始位點序列進行了特征提取。利用留一法交叉驗證來計算模型的預測精度,結果表明核小體位點的預測模型Acc達到了87.38%,auROC達到了0.933;人類復制起始位點的預測模型Acc達到了75%,auROC達到了0.835。此外,為了更好的評估模型的性能,我們還比對了不同的機器學習算法,包括決策樹、樸素貝葉斯等,結果顯示,我們構建的兩個預測模型在各個評價指標上都具有一定的優勢。我們還開發了一個免費的在線服務軟件,科研人員可以通過訪問http://lin.uestc.edu.cn/server/iOri-Human.html網站對未知的序列進行預測。最后,通過研究復制起始位點的所有子序列是否為核小體序列來研究復制起始位點鄰近區域的核小體分布情況。結果表明復制起始位點鄰近區域形成核小體的概率低于其他區域,證實了本文構建的核小體預測模型具有一定的實用性。
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