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        [碩士論文] 伍歡
        地理環境與污染控制 浙江師范大學 2018(學位年度)
        摘要:碘代乙酰胺(Iodinated haloacetarnides,I-HAcAms)是飲用水中的新興消毒副產物(disinfection by-products,DBPs),因為極強的細胞毒性受到廣泛關注,是一類高毒性的含氮消毒副產物(N-DBPs)。但到目前為止,對I-HAcAm的研究報道卻較少,大多集中于形成原理。僅有IAcAm有相對詳細的毒理學報道,其他3種I-HAcAm的毒性機制仍有待研究。因此,有關I-HAcAm細胞毒性的相關研究工作十分值得開展,以期為水務工作者提供更好的毒理學依據,給他們調控DBPs提供方向。基于此,本研究選取4種I-HAcAms,分別是二碘乙酰胺(diiodoacetamide,DIAcAm),碘乙酰胺(iodoacetamide,IAcAm),溴碘乙酰胺(bromoiodoacetamide,BIAcAm),氯碘乙酰胺(chloroiodoacetamide,CIAcAm),并選用人肝癌細胞HepG-2細胞作為研究對象,探討這四種I-HAcAms的細胞毒性及可能的毒性機制。結果如下:
          1)4種I-HAcAms均會引起HepG-2的細胞毒性,細胞毒性強弱為:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。細胞毒性呈現濃度時間依賴性,隨著濃度增加,暴露時間延長,細胞毒性增強。其中,DIAcAm、BIAcAm和CIAcAm的IC50值與正辛醇-水分配系數(logarithm of the octanol-water partition coefficient,log P)高度相關,log p值越大,親脂性越強,穿過細胞膜的能力也越強,造成的細胞毒性越大。IAcAm的毒性高于二鹵代的BIAcAm和CIAcAm是因為與之相比,鹵素原子少,并且碘離子的鍵長長,解離能弱,很容易離去,對細胞造成毒性。
          2)4種I-HAcAms均會刺激HepG-2的ROS產生,ROS生成勢大小為:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。ROS的生成呈現濃度依賴性,隨著濃度增加,ROS的生成量增加。除了ROS,Nrf-2和GCLC也是反映細胞氧化應激水平的關鍵指標。Nrf-2在機體內是維持氧化還原狀態的一個元件,GCLC是其下游的一個抗氧化酶。實驗表明,I-HAcAm會使HepG-2細胞中的Nrf-2和GCLC的基因蛋白表達水平上調,并且隨著濃度的增加而增加,佐證了I-HAcAms會導致HepG-2細胞氧化損傷。
          3)4種I-HAcAms均會導致HepG-2的細胞凋亡產生。細胞凋亡率排序為:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。細胞凋亡呈現濃度時間依賴性,隨著濃度增加,暴露時間延長,凋亡率呈上升趨勢。Bax和Bcl-2分別是促凋亡基因蛋白和抗凋亡基因蛋白。I-HAcAms會使HepG-2細胞中的Bax基因蛋白表達上調,Bcl-2基因蛋白表達下調。隨著濃度的增加,Bax/Bcl-2比值越大,凋亡越明顯。
          4)抗氧化劑NAC對細胞毒性有明顯的緩解作用。當HepG-2細胞在抗氧化劑NAC的預處理下,再暴露于I-HAcAms時,由于I-HAcAms引起的細胞抑制和ROS的產生都會得到很好的緩解,甚至可以完全逆轉細胞毒性和氧化損傷。對于細胞凋亡來說,NAC對BIAcAm和CIAcAm引起的凋亡沒有任何影響,但卻可以部分緩解DIAcAm和IAcAm引起的凋亡。說明了I-HAcAms致使的細胞凋亡主要通過線粒體通路。
        [碩士論文] 魏翠云
        生態學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:全氟辛基磺酸鹽(Perfluorooctane sulfonate,PFOS),作為一種典型的全氟類化合物,具有生殖毒性、發育毒性、神經毒性、基因毒性等多種生物毒性效應,但目前關于PFOS影響脂代謝和糖代謝的分子致毒機制尚不清楚。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,Celegans)作為一種模式生物,體內的多不飽和脂肪酸合成通路結合了植物和動物的過程,與高等動物相比,具有完整的從頭合成多不飽和脂肪酸的能力。本文以C.elegans作為研究對象,用不同濃度梯度PFOS暴露C.elegans研究其對脂代謝與糖代謝的影響,主要研究結果有:
          1.建立了C.elegans脂肪酸甲酯化方法,并用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)定量檢測了C.elegans體內9種典型脂肪酸含量,實驗結果表明用0.5%甲酯化試劑(H2SO4/MeOH),甲酯化時間2h,甲酯化回收率較高,且GC-MS檢出限都在ng/mL范圍,遠遠低于C.elegans體內的μg/mL濃度范圍,分析方法靈敏度高。
          2.不同濃度梯度(0,0.01,0.1,0.5,1.5μmol/L)PFOS暴露L1期C.elegans72h,GC-MS定量檢測結果表明PFOS會導致C.elegans中脂肪酸含量降低,與飽和脂肪酸相比,不飽和脂肪酸降低相對顯著;進一步發現脂肪酸合成關鍵基因,如乙酰輔酶A羧化酶的相關基因acc-4,△9去飽和酶的相關基因fat-7相對表達量隨PFOS濃度的增加而顯著下調(p<0.05),說明PFOS可能通過影響脂肪酸合成初期反應關鍵酶的表達,而導致C.elegans體內各脂肪酸含量下降。
          3.脂質代謝與糖代謝與氧化磷酸化水平密切相關,PFOS暴露72h后,C.elegans中葡萄糖含量也隨PFOS濃度的升高而降低,1μmol/L PFOS暴露后C.elegans中的丙酮酸和ATP含量都顯著降低于對照組(p<0.05);我們分別測定了C.elegans體內與葡萄糖代謝有關的糖異生、糖酵解和胰島素通路中相關基因pck-1,pyk-1,pyk-2,pfk-1.1,gpd-2,ctl-1,daf-2,daf-16的相對表達量,結果表明PFOS暴露可能通過影響C.elegans體內與糖代謝相關基因的相對表達,從而導致C.elegans體內糖代謝紊亂;PFOS暴露會導致C.elegans中脂肪酸、葡萄糖含量的降低,而丙酮酸和ATP含量下降,提示三羧酸循環也發生紊亂,這可能是PFOS暴露造成C.elegans死亡的原因。
          總之,本文建立了靈敏可靠的C.elegans體內脂肪酸的GC-MS分析方法,定量測定了PFOS暴露對C.elegans體內脂肪酸代謝及相關基因表達的影響,并進一步分析了PFOS暴露對C.elegans體內糖代謝和三羧酸循環的影響,實驗結果表明PFOS可以顯著抑制C.elegans體內脂代謝、糖代謝和ATP的合成,具有明顯的毒性效應。
        [碩士論文] 成厚城
        水生生物學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:近年來,藍藻水華及其次生代謝產物藍藻毒素對生態環境和人類健康造成嚴重威脅。微囊藻毒素(MCs)是自然界中最為常見、危害最大的一類藍藻毒素,而微囊藻毒素-LR(MCLR)是MCs中毒性最強,研究最多的一種。針對MCLR對自然水體的污染可能會對生態環境及人類健康造成的潛在危害,本文以斑馬魚為實驗動物,研究了MCLR對斑馬魚生殖及子代生長發育的影響。主要結果及結論如下:
          環境相關濃度(0、0.5、4和32μg/L)MCLR暴露21天后,斑馬魚的產卵量顯著降低,且MCLR在肝、腦、性腺等器官中大量積累。進一步研究發現,MCLR暴露降低了斑馬魚血漿中雌二醇(E2)和睪酮(T)的含量,改變了下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸上相關基因的表達水平。此外,我們以納米二氧化鈦(n-TiO2)為例探討了MCLR與具有吸附效應的納米材料聯合暴露對斑馬魚生殖的影響。結果表明,MCLR與n-TiO2聯合暴露進一步降低了斑馬魚的產卵量;與MCLR單獨暴露相比,MCLR與n-TiO2聯合暴露進一步降低了雌魚血漿中E2和T的含量,顯著增加了MCLR在肝、腦、性腺中的生物積累量。我們推測MCLR積累量增加可能是斑馬魚產卵量進一步降低的主要原因。
          環境相關濃度(0、1、5和25μg/L)MCLR暴露母體(F0)45天,可顯著抑制子代(F1)的體長,降低了母體和子代甲狀腺激素(T4和T3)的含量,影響了甲狀腺激素代謝相關基因的表達。進一步分析研究結果發現,MCLR母體暴露引起F1代斑馬魚仔魚發育遲緩的作用機制為:(1)MCLR通過抑制母體T4的分泌減少了母體傳遞給子代的T4總量;(2)MCLR通過干擾子代下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸上相關基因的表達抑制了子代T4的分泌。
        [博士論文] 李靜
        水生生物學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP)是一種典型的有機磷酸酯類阻燃劑,因其優良的阻燃性能,以及全球范圍內對溴代阻燃劑(如多溴聯苯醚)的逐漸禁用,使得TDCIPP作為良好的替代品近年來被大量生產并廣泛使用。由于TDCIPP是以物理添加的形式被應用在產品中的,因此極易釋放進入環境中。環境監測表明,TDCIPP在空氣、自然水體、土壤和野生生物的組織中具有很高的檢出率,對野生生物和人類的生存和繁衍可能構成潛在的威脅。已有的毒理學研究表明,TDCIPP能夠引起脊椎動物多種毒性效應,然而對低等生物的影響及多代毒性效應仍是未知,故本研究選取營自由生活的低等水生原生動物嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)為實驗生物,通過較高濃度TDCIPP(0.01,0.1和1μmol/L)亞慢性暴露(5d)和環境相關濃度(300和3000ng/L)多代暴露60d(約372代)及恢復實驗,以表型觀測、轉錄組測序分析、實時定量PCR檢測和透射電子顯微鏡觀察為研究手段,對TDCIPP的毒性效應及分子機制進行了評價和探討。主要結果如下:
          (1)采用高濃度(1,10,100,1000和10000μmol/L)急性暴露(8h),研究了TDCIPP對嗜熱四膜蟲生物量的劑量-依賴性抑制效應,EC50為615.1μmol/L。0.01,0.1和1μmol/L TDCIPP亞慢性暴露,通過引起細胞密度、細胞大小和纖毛數量劑量-依賴性降低,從而導致生物量顯著性降低,表明抑制個體生長和繁殖是TDCIPP的主要毒性效應。RNA-Seq檢測及KEGG富集分析,發現差異表達基因顯著性富集于核糖體通路,TDCIPP誘導核糖體大、小亞基上的12個核糖體蛋白基因呈現劑量-依賴性的下調表達。此外,伴隨著核糖體蛋白基因的下調表達,細胞質和粗面內質網上的核糖體數量減少,細胞質中核糖體增大。本實驗結果表明,TDCIPP可能通過靶向作用于核糖體影響嗜熱四膜蟲的生長和繁殖。
          (2)多代毒性效應評價實驗中,使用環境相關劑量TDCIPP對嗜熱四膜蟲開展連續約372代(60d)的暴露實驗,隨后進行約372代的恢復實驗。結果發現,TDCIPP暴露引起嗜熱四膜蟲種群數量、個體大小和纖毛數量降低;同時,TDCIPP引起纖毛的基體結構發生改變,基體深度和直徑顯著性降低;此外,TDCIPP誘導了與纖毛組裝和維持相關的基因(ift家族的3個基因:ift52,ift81和ift172,tcp-1家族的7個基因:tcp-1-3700.m00089,tcp-1-3706.m00106,tcp-1-3715.m00106,tcp-1-3731.m00045,tcp-1-3698.m00091,tcp-1-2.m02183和tcp-1-16.m00478)表達上調。在60d的恢復實驗中,種群數量恢復至正常水平,然而,TDCIPP對嗜熱四膜蟲個體大小、纖毛數量、基體結構及相關基因的影響中部分效應有恢復跡象,大多效應依舊顯著性存在。因此,本研究首次表明環境相關劑量TDCIPP對嗜熱四膜蟲多代暴露顯示出發育和繁殖毒性,且部分效應在實驗時間內不可恢復。
          (3)為進一步闡明TDCIPP引起多代毒性效應的作用機制,開展環境相關劑量(300和3000ng/L)TDCIPP對嗜熱四膜蟲連續約372代的暴露及后續約248代的恢復實驗。在此次實驗中,TDCIPP對嗜熱四膜蟲表型的抑制效應與之前的多代暴露結果一致,恢復效應也相同。另外,此次實驗還發現,TDCIPP引起細胞粗面內質網池擴張,其上附著的核糖體排列不規則,細胞內這種超微結構變化在恢復實驗階段依舊存在。通過RNA-Seq及KEGG富集分析發現,在暴露和恢復時期,下調表達的差異基因均顯著性富集于核糖體通路,TDCIPP誘導核糖體大、小亞基上的核糖體蛋白基因普遍呈現劑量-依賴性下調表達,說明TDCIPP抑制了核糖體功能。此外,在恢復時期,上調表達的差異基因顯著性富集于核糖體生物合成通路,推測這可能是嗜熱四膜蟲對TDCIPP抑制其核糖體功能所表現出的積極的恢復響應。
        [碩士論文] 王冰潔
        臨床獸醫學 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:玉米赤霉烯酮(ZEA)又稱F-2毒素,該毒素廣泛存在于動物飼料以及人們的食糧中,其中ZEA的生殖發育毒性、免疫毒性對畜牧業的發展和全人類的健康具有潛在威脅。近年來,ZEA的雄性生殖毒性越來越受到人們的關注,但到目前為止,有關ZEA雄性生殖毒性及其毒性機理認識與研究仍存在不足。眾所周知,睪丸支持細胞(Sertolicells,SC)的數量不僅為成年雄性動物睪丸的發育提供營養物質,還影響其生精能力,SC細胞在精子發生過程中起著不可替代的作用。本試驗通過建立體外模型,利用透射電鏡、流式細胞術和western-blot等技術,研究了ZEA對SC細胞周期分布的影響及自噬的作用,旨為揭示ZEA雄性生殖毒性的機理。
          1、ZEA對SC細胞周期分布的影響。以原代大鼠SC細胞為材料,利用CCK-8法檢測了ZEA對SC細胞活率的影響并篩選出小于40μmol/L的ZEA為使用濃度,隨后選取不同濃度ZEA(0,0.1、1、10、20、30μmol/L)處理24h,利用流式細胞術、免疫熒光技術和Western-blot等細胞周期分布及細胞周期相關蛋白的影響。結果顯示:相比較與對照組,隨著ZEA濃度的升高,ZEA處理組SC細胞活力均受到顯著或極顯著性抑制,(P<0.05或P<0.01);當ZEA濃度高于10μmol/L時,G0/G1期比例顯著下降(P<0.05)、G2/M期的比例極顯著升高(P<0.01);10μmol/L ZEA及以上劑量組均極顯著上調p-Cdc2/Cdc2、下調CyclinB1、Cdc25B、p-Histone H3等蛋白表達水平(P<0.01);免疫熒光法檢測的細胞有絲分裂期的Maker蛋白p-Histone H3表達的結果與免疫印跡結果一致。結果表明:ZEA可以通過影響G2期調控點關鍵因子——CyclinB1的表達、p-Cdc2/Cdc2激酶和Cdc25B磷酸酶的活性來抑制體外培養中SC細胞的增殖,并將細胞周期阻滯在G2期。
          2、ZEA對SC細胞自噬的影響。用不同濃度的ZEA(0,0.1、1、10、20、30μmol/L)處理大鼠原代SC細胞24h后,免疫熒光法、透射電鏡、Western-blot等技術檢測了ZEA對SC細胞細胞自噬水平誘導的影響。結果顯示:20μmol/L的ZEA處理SC細胞可導致細胞胞質內自噬體形成;隨著ZEA濃度的升高,SC細胞內LC3聚點數增多,各染毒組均較對照組有極顯著差異(P<0.01);用單丹磺酰尸胺(MDC)染色法觀察晚期自噬溶酶體的變化,發現各染毒組細胞內酸性囊泡的數目均較對照組極顯著增多(P<0.01),且呈劑量依賴性;與對照組相比,p62蛋白表達顯著下降,當ZEA的濃度達到10μmol/L時Atg5的表達量逐漸減少,各染毒組均較對照組有顯著或極顯著差別(P<0.05或P<0.01);各染毒組細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、Atg7的表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)。為進一步檢測細胞自噬流的狀態,試驗使用自噬晚期抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)刺激細胞,結果顯示,Bafilomycin A1+20μmol/LZEA組LC3蛋白表達量較單獨Bafilomycin A1處理組的表達量呈差異極顯著升高(P<0.01),但泛素化蛋白p62的降解較ZEA單獨處理組呈差異極顯著降低(P<0.01)。結果表明,ZEA對SC細胞產生細胞毒性,并誘導SC細胞發生自噬。
          3、PI3K/Akt/mTOR信號通路在ZEA誘導SC細胞自噬中的作用。用不同濃度的ZEA(0、0.1、1、10、20μmol/L)的ZEA處理大鼠原代SC細胞24h,利用免疫印跡法檢測PI3K/Akt/mTOR通路中關鍵蛋白的磷酸化水平;為進一步探究該信號通路在ZEA在SC細胞自噬誘導中的作用,隨后加入PI3K通路抑制劑LY294002(10μmol/L)與20μmol/LZEA單獨或聯合處理細胞24h,通過western-blot、免疫熒光法檢測Akt、m TOR蛋白磷酸化水平和LC3含量的變化,以及細胞內LC3的聚點現象。結果顯示:隨著ZEA濃度的上升,PI3K、mTOR、P70S6K、GSK2β蛋白的磷酸化水平逐漸下降,20μmol/L時各蛋白磷酸化水平較對照組有顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01);與ZEA組比較,LY294002與ZEA聯合組細胞Akt、mTOR蛋白磷酸化水平極顯著下降(P<0.01),LC3Ⅱ表達量呈極顯著升高(P<0.01),細胞內LC3聚點數量顯著升高,熒光強度顯著增強。結果表明:ZEA可以通過啟動并下調PI3K/AKT/mTOR信號通路,該信號通路的啟動在ZEA誘導SC細胞自噬中起負調控作用。
          4、ZEA誘導的自噬以及PI3K/AKT/mTOR信號通路的啟動在SC細胞周期分布中作用。為探討自噬在ZEA對SC細胞周期影響中的作用及自噬影響ZEA對SC細胞周期分布的具體機制,試驗分別采用ZEA(20μmol/L)與自噬抑制劑-氯喹(CQ)、促進劑-雷帕霉素(RAPA)、以及自噬相關通路PI3K通路抑制劑(LY294002)聯合處理SC細胞后,利用流式細胞術、免疫熒光技術和Western-blot等技術檢測了細胞周期分布、周期相關蛋白等的表達。結果顯示:與ZEA組相比,CQ+ZEA組細胞周期的G2/M期的比例降低(P<0.05),RAPA+ZEA組細胞周期的G2/M期的比例升高(P<0.05);CQ+ZEA組CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2等蛋白的表達量降低(P<0.05),RAPA+ZEA組顯著升高(P<0.05)。與ZEA組相比,LY294002+ZEA組細胞G2/M期阻滯的比例降低(P<0.05),細胞周期關鍵激酶Cdc2/p-Cdc2的活性增強(P<0.05)。結果表明,啟動并下調自噬相關通路PI3K/Akt/mTOR后,可以部分逆轉ZEA誘導SC細胞G2/M期的阻滯。
          結論認為,ZEA能抑制細胞增殖,影響SC細胞的周期的分布,并誘導G2期阻滯;在一定濃度范圍內,ZEA可以通過啟動并下調PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導細胞自噬的發生,從而部分逆轉ZEA誘導SC細胞G2/M期的阻滯。
        [博士論文] 張坤
        畜牧學;畜牧系統管理學 東北農業大學 2018(學位年度)
        摘要:錳(Mariganese,Mn)是一種人和動物必需的微量元素,隨著錳在工業和農業廣泛使用,引起了錳污染。神經系統是過量錳作用的對象之一,錳污染能使工人出現精神疾病癥狀,影響兒童智力發育。畜禽誤食過量錳會出現精神萎靡癥狀,甚至死亡,造成畜禽養殖損失。本試驗旨在研究過量錳對雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡的影響,為雞錳神經毒性提供基礎數據,同時為診斷、治療畜禽生產中動物錳中毒提供參考。
          本試驗包括體內試驗和體外試驗。體內試驗中,將240只1日齡海蘭公雞用標準日糧飼喂7天,然后隨機分為對照組和3個處理組,對照組飼喂標準日糧(含錳127.88mg/kg),3個處理組在標準日糧中分別添加不同水平氯化錳,使日糧錳水平分別達到600、900和1800mg/kg。飼喂30、60和90天時采集雞大腦、小腦、丘腦和腦干組織進行相關指標的檢測。體外試驗中,取6-8日齡雞胚,分離出雞胚神經細胞。試驗分為一個對照組和6個錳處理組,對照組使用DMEM培養基培養,6個處理組在DMEM培養基添加不同濃度的氯化錳,使培養基中氯化錳的濃度分別達到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mM,培養12、24、36和48小時時,收集細胞,進行相關指標的檢測。雞飼養和采集樣品時觀察雞臨床癥狀和剖檢癥狀,采用火焰原子吸收法和石墨爐原子吸收法分別檢測雞腦組織和血液錳含量,采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法和醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色法分別觀察雞腦組織顯微和超微結構,采用細胞計數試劑盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)法和吖啶橙/溴化乙錠(Acridine orange/Ethidium bromide,AO/EB)雙染色法分別檢測雞胚神經細胞活力和凋亡狀態,采用試劑盒法檢測雞腦組織和雞胚神經細胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)活性和一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量和誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性,采用實時定量PCR法(Real time quantitative PCR,qPCR)檢測炎癥因子核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、iNOS、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase,PTGEs)、細胞因子白細胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、IL-7、IL-I0、IL-17、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和轉化生長因子-β4(Transforming growth factor-β4,TGF-β4)、凋亡基因p53、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、B細胞淋巴瘤-加長(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-x)、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(B-cell lymphoma2-associated X protein,Bax)、B細胞淋巴瘤2同源拮抗劑/殺手(B-cell lymphoma2homologous antagonist/killer,Bak)、fas和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和熱休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90mRNA表達,采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測炎癥因子NF-κB、iNOS和PTGEs,凋亡基因p53、Bcl-2、Bax和caspase-3和熱休克蛋白HSP60、HSP70和HSP90蛋白表達。結果表明:
          (1)過量錳導致雞腦組織和血液錳含量升高,且雞腦組織錳具有時間和劑量效應,雞血液錳具有劑量效應,過量錳導致雞腦組織錳蓄積。
          (2)過量錳導致雞腦組織炎癥損傷,炎癥損傷程度隨著錳處理劑量和處理時間的增加而增加。過量錳誘導雞腦組織和雞胚神經細胞炎癥因子NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2和PTGEs mRNA表達以及NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表達,增加NO含量和iNOS活性,且雞腦組織的以上指標具有時間和劑量效應量,雞胚神經細胞炎癥因子蛋白表達具有劑量效應和時間效應,雞胚神經細胞炎癥因子mRNA表達、NO含量和iNOS活性具有劑量效應。過量錳導致雞腦組織和雞胚神經細胞炎性反應和炎性損傷。
          (3)過量錳從組織形態學角度導致了雞腦組織凋亡,且隨著錳處理劑量和處理時間的增加,雞腦組織凋亡程度加劇。過量錳從細胞形態學角度導致雞胚神經細胞凋亡,且細胞凋亡的數目隨著劑量的增加而增加。過量錳誘導了雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡基因p53、Bax、Bak、fas和caspase-3mRNA表達以及p53、Bax和caspase-3蛋白表達,抑制了Bcl-2和Bcl-x mRNA表達以及Bcl-2蛋白表達。雞腦組織凋亡基因mRNA和蛋白表達以及雞胚神經細胞凋亡基因蛋白表達具有劑量效應和時間效應,雞胚神經細胞凋亡基因mRNA表達具有劑量效應。過量錳導致雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡。
          (4)過量錳降低了雞腦組織和雞胚神經細胞SOD和T-AOC活性,且雞腦組織SOD和T-AOC活性具有劑量效應和時間效應,雞胚神經細胞SOD和T-AOC活性具有劑量效應。過量錳導致了雞腦組織和雞胚神經細胞氧化應激。
          (5)過量錳誘導了雞腦組織和雞胚神經細胞細胞因子IL-7和IFN-γmRNA表達,抑制了細胞因子IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β4mRNA表達,且雞腦組織細胞因子mRNA表達具有劑量效應和時間效應,雞胚神經細胞細胞因子mRNA表達具有劑量效應。過量錳引起了雞腦組織和雞胚神經細胞免疫反應。
          (6)過量錳誘導雞腦組織和雞胚神經細胞熱休克蛋白HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90mRNA表達以及HSP60、HSP70和HSP90蛋白表達。雞腦組織熱休克蛋白mRNA和蛋白表達以及雞胚神經細胞熱休克蛋白蛋白表達具有劑量效應和時間效應,雞胚神經細胞熱休克蛋白mRNA表達具有劑量效應。熱休克蛋白在過量錳誘導的雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡中發生保護性反應。
          (7)過量錳對大腦NF-κB和TNF-αmRNA表達,NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表達韻影響最大,對丘腦Bcl-2、HSP60和HSP90蛋白表達的影響最大,對大腦和丘腦NF-κB、IL-4和IL-17mRNA表達以及p53蛋白表達的影響最大。過量錳對大腦和丘腦的毒性大于小腦和腦干的毒性。
          過量錳導致雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡,氧化應激、炎性損傷、免疫反應和熱休克蛋白參與了過量錳導致的雞腦組織和雞胚神經細胞凋亡。
        [碩士論文] 蔣凡
        水生生物學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:磷酸三(2-丁氧基)乙酯(Tris(2-butoxyethyl) phosphate,TBOEP)是一種能夠對水生生物及其相關生態系統帶來嚴重風險的環境污染物。近年來,有報道研究了TBOEP暴露對生物體造成生殖、發育等方面的毒性。然而,很少有報道評估其對斑馬魚幼魚神經毒性作用。在本研究中,受試動物斑馬魚胚胎在受精后(post-fertilization,hpf)2 h內分別暴露在0,50,500,1500和2500μg/L的TBOEP中144hpf。行為測試結果表明,TBOEP暴露降低了胚胎自主運動以及幼魚在黑暗刺激反應中的平均游泳速度。根據這些運動效應,TBOEP暴露可降低轉基因斑馬魚Tg(HuC-GFP)體內特異性神經元表達,抑制次級運動神經元軸突的生長,降低與中樞神經系統發育有關的標記基因的表達水平。此外,檢測到TBOEP暴露組中幼魚活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平下降、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量增加以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性降低。結果表明,運動神經元和氧化應激的改變能夠引起TBOEP誘導運動行為改變。本實驗結果如下所示:
          1.結果顯示,經TBOEP處理96 hpf的幼魚孵化率和144hpf的存活率僅在最高處理組中出現顯著降低。同時,暴露于500,1500和2500μg/L的TBOEP中的幼魚心率在96 hpf顯著下降。此外,144hpf時,500,1500和2500μg/L TBOEP處理組中的幼魚體長與對照組幼魚體長相比明顯降低。然而,與對照樣品比較,TBOEP的暴露并未顯著影響畸形率。
          2.在對照組中,胚胎于20hpf時開始左右交替收縮,并且在22 hpf時逐漸達到16 bends/min的峰值,然后在28 hpf時緩慢下降到9 bends/min;暴露于500,1500和2500μg/L TBOEP中的胚胎自發運動的發作時間(~20 hpf)沒有發生變化,但在22 hpf時彎曲頻率顯著降低;2500μg/L TBOEP處理組中的幼魚在20-28hpf時自發運動顯著降低。
          在光暗交替周期刺激下進一步評估144hpf幼魚的運動活性。當幼魚從黑暗到光照時,游泳速度通常迅速下降,反之亦然。在5分鐘的黑暗期間,1500和2500μg/L TBOEP處理組中幼魚的平均游泳速度與對照組相比顯著下降。
          3.形態學分析顯示,暴露于1500和2500μg/L TBOEP中幼魚次級運動神經元背部和腹部軸突的長度顯著減少。我們通過qRT-PCR進一步評估了與軸突發育相關基因的表達。同對照組相比,α1-tublin的表達僅在2500μg/L TBOEP處理組中明顯下降;暴露于500,1500和2500μg/L TBOEP中的幼魚,shha和syn2a的轉錄水平在144 hpf顯著下調;經不同濃度TBOEP處理的幼魚,gap43的轉錄水平顯著下調。
          4.同對照組相比,轉基因斑馬魚Tg(HuC-GFP)暴露于1500和2500μg/L的TBOEP中144 hpf,幼魚腦和脊髓中特異性神經元表達明顯下降;然而,較低濃度TBOEP暴露組(50和500μg/L)中幼魚腦和脊髓中特異性神經元表達與對照組相比沒有明顯差異。
          5.同對照組相比,50,500,1500和2500μg/L TBOEP暴露組中幼魚mbp和gfap的表達顯著下調;同時,暴露于500,1500和2500μg/L TBOEP處理組中,elavl3和nkx2.2a的轉錄水平顯著下調;暴露于2500μg/L TBOEP后,nestin和nr4a2b的表達顯著降低;此外,neurogenin和ache的表達沒有發生明顯變化。
          6.同對照組相比,500,1500和2500μg/L TBOEP處理組中幼魚ROS活性明顯升高;同時,僅在2500μg/L TBOEP暴露組中觀察到MDA含量明顯增加;暴露于1500和2500μg/L TBOEP中幼魚SOD活性降低。
          總之,這些結果表明,TBOEP暴露對斑馬魚幼魚的神經行為產生了一定的改變,同時也影響了與斑馬魚幼魚運動行為相關的次級運動神經元軸突的形成與生長。因此,我們不應該忽視水生環境中TBOEP的毒性影響,需要對其致毒機制做進一步的研究。
        [碩士論文] 王倩
        生態學 哈爾濱師范大學 2018(學位年度)
        摘要:近年來,全球范圍內兩棲類的數量有急劇下降的趨勢,已有研究表明,兩棲類的數量下降與其所處環境的污染有一定的關系,而農藥的大量使用又是造成環境污染的重要原因。本研究以東北地區常見的兩種有尾兩棲類(極北鯢和東北小鯢)為研究對象,以常用的除草劑阿特拉津和殺蟲劑毒死蜱為染毒物,檢測了這兩種農藥對這兩種有尾類蝌蚪的急性毒性、生長發育毒性、氧化應激損傷,并通過HE染色,從病理學角度分析了兩種農藥對蝌蚪肌肉和肝臟的病理損傷。
          急性毒性實驗結果表明,阿特拉津對極北鯢蝌蚪和東北小鯢蝌蚪96h的LC50分別為2.63mg/L、4.29mg/L;毒死蜱對極北鯢蝌蚪和東北小鯢蝌蚪96h的LC50分別為0.11mg/L、0.16mg/L;二者混合液對極北鯢蝌蚪和東北小鯢蝌蚪96h的LC50分別為0.18mg/L、0.28mg/L。
          生長毒性實驗表明:阿特拉津和毒死蜱無論是單一暴露還是聯合暴露,都會抑制蝌蚪的體長和體重,且濃度越高抑制作用越大。暴露末期各染毒物高濃度組對東北小鯢蝌蚪體長和體重的抑制率分別為:阿特拉津15.3%、17.2%;毒死蜱16.2%、18.4%;聯合22.6%、34.6%。各染毒組對極北鯢蝌蚪體長和體重的抑制率分別為:阿特拉津15.1%、18.1%;毒死蜱17.6%、24.7%;聯合27.6%、34.8%。
          隨著暴露濃度的增加和暴露時間的延長,SOD、CAT、GSH-PX整體呈下降趨勢,MDA含量呈上升趨勢。暴露末期,與對照組相比,東北小鯢蝌蚪SOD、CAT、GSH-PX分別降低32.6%、58.8%、29.6%;極北鯢蝌蚪SOD、CAT、GSH-PX分別降低52.3%、73.4%、54.3%。
          HE染色結果顯示:經染毒后,極北鯢和東北小鯢蝌蚪出現肝細胞腫大、染色質減少,肌肉組織發炎,肌纖維斷裂、崩解等現象。通過恢復實驗發現,當環境得到改善時,無論是生長發育、組織病理學還是抗氧化酶活性,機體在一定程度上都會得到修復。
          本研究從不同角度探討了阿特拉津和毒死蜱對極北鯢蝌蚪和東北小鯢蝌蚪的毒理影響,充實了農藥對兩棲類毒理影響的研究,以期為農藥的合理使用和兩棲類的環境保護提供重要的理論依據。
        [碩士論文] 崔永薈
        基礎獸醫學 華中農業大學 2018(學位年度)
        摘要:全氟烷基酸(PFAAs)具有優異和獨特的親水親脂特性,因而在工業、家庭和其他領域具有廣泛的應用,同時它們在環境中具有很高的溶解性和化學穩定性,可持久性存在,且具有生物累積性和毒性。全氟辛酸被證實與高膽固醇血癥、潰瘍性結腸炎、甲狀腺疾病、先兆子癇、腎癌和睪丸癌有關聯。據報道,人類血液中能夠檢測到全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸等一系列PFAAs殘留,肝臟中也有PFAAs殘留的報道,這表明PFAAs是可能與人類健康有關的普遍污染物。已有研究表明大鼠可將多氟烷基磷酸二酯、氟調聚醇等氟化前體生物轉化成PFAAs,PFAAs的前體對于人類暴露PFAAs的重要性才突顯出來。8-2氟調聚醇(8-2FTOH)具有最大的生產量且被證實是PFOA的前體物質,從而吸引了科學家的廣泛關注。
          已知8-2FTOH的代謝物全氟羧酸在植物組織、動物組織、蛋和牛奶中可被吸收和濃縮,通過食物鏈進行生物放大,因此人類可通過多種途徑接觸到8-2FTOH和全氟羧酸,如吸入粉塵、飲用水和食物消費(包括母乳、魚、海鮮、肉類和肉類產品)。用作飼料的植物已顯示能夠從土壤中吸收全氟羧酸并將其積累在營養器官和貯藏器官中,家畜可通過飲用水和動物飼料暴露,因此動物性食品是人類潛在的主要暴露來源。為了確定8-2FTOH在食品動物體內代謝為PFOA的程度,確定代謝產物的毒理作用,有必要對其在豬和雞體內進行代謝和殘留消除研究。本課題根據已有報道,建立了液質聯用檢測豬和雞樣品中8-2FTOH及其代謝物的定量方法,建立了LC/MS-Q-TOF鑒定豬和雞排泄物中代謝物的定性方法,并利用建立的定量定性方法研究了8-2FTOH在豬和雞體內的代謝和殘留消除規律。
          1豬和雞樣品中8-2FTOH及其代謝物的定量方法建立
          本課題以8-2FTOH及其代謝物全氟戊酸(PFPeA)、全氟己酸(PFHxA)、全氟庚酸(PFHpA)、PFOA、全氟壬酸(PFNA)、8-2氟調聚酸(8-2FTCA)、8-2不飽和氟調聚酸(8-2FTUCA)、7-3氟調聚酸(7-3FTCA)為研究對象,建立了分散固相萃取結合LC-MS/MS測定動物樣品中化合物的含量的方法。通過對前處理條件的優化,確定樣品以乙腈為提取試劑,吸附劑C18、PSA、GCB用以凈化雜質,提取液氮吹至0.5mL與初始流動相1∶1混合后上機檢測。流動相采用5mmol/L乙酸銨和甲醇,以Poroshell EC-C18為色譜柱,多反應監測下負離子模式掃描,離子源溫度為200℃,結果顯示9種化合物在17min內分離良好。PFPeA、PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA在豬和雞所有樣品中(排泄物、血漿、肝臟、腎臟、肌肉、脂肪、心、肺、胃、大腸以及小腸)的定量限為0.3μg/kg,檢測限為0.1μg/kg;8-2FTCA、8-2FTUCA、7-3FTCA在豬和雞所有樣品中的定量限為0.5μg/kg,檢測限為0.15μg/kg;8-2FTOH在豬和雞所有樣品中的定量限為5μg/kg,檢測限為1.5μg/kg。經方法學考核后,各化合物在豬和雞所有樣品中的平均回收率超過70%,日間相對標準偏差小于13%。
          28-2FTOH在豬和雞體內的代謝研究
          本課題采用LC/MS-Q-TOF鑒定豬和雞排泄物中8-2FTOH及其代謝物,使用LC-MS/MS對排泄物中的目標化合物進行定量測定,來確定8-2FTOH的代謝方式。健康三元雜交豬和28日齡科寶肉雞按125mg/kg.b.w.劑量單次灌服8-2FTOH,6h、12h、24h及每隔24h后收集排泄物,直至168h。結果顯示,7d內豬和雞排泄物中化合物的回收率分別為81.5%和80.4%;其中在豬糞便和尿液中回收率分別為77.3%和4.2%,表明8-2FTOH在豬體內主要通過糞便排泄;8-2FTOH原形是豬和雞排泄物中的主要物質。根據分子量、二級質譜以及化合物代謝規律的對比,除有標準品對照的8種代謝物外,還在豬和雞排泄物中檢測到了文獻中報道過的8-2FTOH葡糖醛酸結合物和8-2FTOH硫酸酯結合物,表明8-2FTOH的代謝規律在不同動物種屬中是一致的。
          38-2FTOH在豬和雞體內的殘留消除規律研究
          連續7d給豬和雞按5mg/kg.b.w.的劑量灌胃8-2FTOH,于停止暴露后6h、1d、3d、7d、14d、21d宰殺動物,取其肝臟、腎臟、肌肉、脂肪、心、肺、胃、大腸以及小腸冷凍保存,按上述所建定量方法對組織中目標化合物進行定量測定,分析8-2FTOH及其代謝物在兩種動物中的分布和殘留規律,確定8-2FTOH及其代謝物在動物中殘留時間較長的組織。研究結果顯示:
          豬:停止暴露8-2FTOH后,所有時間點豬的所有組織中都未檢測到PFNA,21d時豬的肝臟和腎臟中仍能檢測到PFHpA、PFOA、7-3FTCA,其余組織中能檢測到PFHpA、PFOA。PFHpA、PFOA、7-3FTCA在豬肝臟中的消除半衰期分別為9.2d、16.1d、6.5d,在豬腎臟中的消除半衰期分別為12.8d、23.9d、8.6d。
          雞:停止暴露8-2FTOH后,21d時雞的所有組織都能檢測到PFOA、PFNA、7-3FTCA,但在肝臟和腎臟中的濃度較高。PFOA、PFNA、7-3FTCA在雞肝臟中的消除半衰期分別為3.7d、17.3d、7.0d,在雞腎臟中的消除半衰期分別為4.2d、22.4d、5.5d。雞體內化合物PFPeA、PFHxA、PFHpA、8-2FTCA、8-2FTUCA存在的時間點都要少于豬,說明了8-2FTOH在雞體內的代謝要快于豬。
          綜上所述,本課題首次建立了分散固相萃取法檢測動物樣品中8-2FTOH及其代謝物,獲取了8-2FTOH在豬和雞體內的代謝途徑,闡明了代謝規律和種屬特點;系統闡明了8-2FTOH在豬和雞體內的殘留消除規律,填補了8-2FTOH在食品動物中的研究空白,為8-2FTOH的毒理作用觀察提供了新的參考信息。
        [碩士論文] 張怡
        臨床獸醫學 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:鎘(cadmium,Cd)是環境中常見的污染物之一,能引起人及動物體多種器官的損傷。肝臟作為機體內重要的解毒器官,是鎘毒性損傷的重要靶器官之一。自噬是細胞清除受損細胞器、蛋白質等的主要途徑之一,對維持細胞穩態至關重要。在多細胞生物體中,細胞間存在多種交流方式,縫隙連接通訊(gap junctional intercellular communication,GJIC)是細胞間的直接通訊方式之一。研究表明,鎘可引起細胞自噬水平的升高以及GJIC功能的下降,其內在機制尚未完全闡明。本試驗以大鼠肝細胞系BRL3A為研究對象,建立鎘損傷時間梯度模型,探究鎘暴露不同時間對BRL3A細胞的自噬水平和GJIC功能的影響,以及GJIC對自噬的調控機制,為進一步闡明鎘致肝細胞毒性機理提供理論依據。
          本文主要從以下幾方面進行論述:
          1.鎘對BRL3A細胞損傷的時間效應
          為了探究鎘對BRL3A細胞的毒性損傷,根據細胞實時分析技術(RTCA)呈現的5μmol/L鎘對BRL3A細胞指數的影響結果,建立鎘損傷細胞0h、1.5h、3h、6h、12h及24 h共6個時間段的時間梯度模型。Hoechst33258染色觀察細胞核的變化,透射電鏡觀察細胞超微結構的變化。結果表明,與對照組相比細胞線粒體在1.5h時開始出現損傷,細胞核在3h時開始出現形態學改變,隨著時間的延長,損傷程度逐漸加重,24 h內呈明顯的時間-效應關系。
          2.鎘致BRL3A細胞損傷與自噬的關系
          為了探究鎘對BRL3A損傷過程中自噬的變化,利用透射電鏡觀察自噬體的數量、免疫熒光法觀察LC3聚點現象以及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測自噬相關蛋白的表達。結果表明,5μmol/L鎘作用細胞自噬水平整體呈現先上升后下降的趨勢。在細胞損傷6h時,自噬標志性蛋白LC3Ⅱ水平達到最高,差異極顯著(P<0.01),此時添加自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ),Western blot檢測自噬蛋白結果表明,與Cd及CQ單獨處理組相比,CQ與Cd聯合處理組的P62和LC3Ⅱ的表達水平均升高,差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。說明鎘在促進細胞自噬的同時,也引起了自噬流的阻滯。
          3.鎘致BRL3A細胞損傷與GJIC的關系
          為探究鎘對BRL3A細胞GJIC的影響,利用劃痕示蹤法檢測GJIC的功能、免疫熒光法觀察連接蛋白Cx43的分布和表達、Western blot檢測GJIC相關蛋白的表達水平。結果表明,5μmol/L鎘作用細胞對GJIC具有抑制作用,與鎘暴露1.5 h相比,鎘暴露3h時抑制減弱,Cx43蛋白表達量也相對升高,6h后Cd對GJIC抑制增強;對照組熒光聚點呈線狀排列在細胞膜上,鎘暴露使Cx43聚點呈團聚集并從胞膜向胞漿內轉移,Cx43和p-Cx43蛋白表達水平均極顯著下降(P<0.01)。
          為了進一步研究GJIC在鎘致BRL3A細胞毒性損傷中的作用,在5μmol/LCd作用細胞6h時,添加GJIC的抑制劑18-β-甘草次酸(18-β-GA)、促進劑全反式維甲酸(ATRA)、Cx43抑制劑Dynasore和Cx43磷酸化抑制劑Ro318220,檢測對GJIC相關指標的影響。結果表明,與鎘單獨處理組相比,聯合添加ATRA能夠極顯著促進LY的擴散距離(P<0.01),促進Cx43在胞膜上的線狀分布和表達,但極顯著增加Cx43磷酸化蛋白的整體表達水平(P<0.01),降低了Cx43蛋白的表達水平(P<0.01);聯合添加GA能夠極顯著抑制LY的擴散距離(P<0.01),減少Cx43在胞膜上的分布及表達,Cx43和p-Cx43蛋白表達水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。10μmol/L Dynasore能極顯著抑制LY的擴散距離(P<0.01);200nmol/LRo318220能極顯著抑制LY的擴散距離(P<0.01),與Cd的聯合處理LY的擴散距離抑制更為明顯。Western blot結果表明,與Cd單獨處理組相比,Dynasore與Cd的聯合處理組能夠極顯著的降低Cx43和p-Cx43蛋白表達水平(P<0.01);而Ro318220與Cd的聯合處理組Cx43的蛋白表達水平極顯著的升高(P<0.01),p-Cx43蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01)。為了明確GJIC對細胞損傷的影響,延長處理時間至12h和24 h觀察細胞形態,與Cd單獨處理組相比,ATRA和Cd聯合處理組加重細胞損傷,GA、Dynasore、Ro318220和Cd聯合處理組減輕了細胞損傷。
          以上結果說明,鎘能夠抑制GJIC功能,但在3h時GJIC功能會代償性增強。鎘引起GJIC的抑制與細胞質膜上Cx43的分布及表達水平密切相關,與Cx43的整體表達水平沒有直接關系,但是與Cx43的磷酸化水平呈正相關。鎘暴露同時,長時間抑制GJIC能夠減少細胞損傷,促進GJIC能夠增強細胞損傷。
          4.鎘致BRL3A細胞損傷中GJIC對自噬的影響
          在細胞損傷6h時,添加GJIC和Cx蛋白相關促進劑和抑制劑,透射電鏡觀察自噬體、免疫熒光法檢測LC3聚點情況、Western blot檢測自噬相關蛋白表達。結果表明,與鎘單獨處理組相比,ATRA與Cd聯合處理組自噬體數量及LC3的表達和分布減少;GA與Cd聯合處理組自噬體數量及LC3的表達和分布增強;GJIC促進劑ATRA能夠極顯著的抑制鎘致BRL3A細胞中自噬相關蛋白Atg7、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ的表達(P<0.01),而抑制劑GA卻相反;Cx蛋白相關抑制劑能夠顯著或極顯著的促進Beclin-1、P62、LC3Ⅱ的表達(P<0.05或P<0.01),表明抑制GJIC能夠促進自噬的水平,促進GJIC能夠抑制鎘誘導的自噬水平。
        [碩士論文] 王京晗
        畜牧學;動物生產 東北農業大學 2018(學位年度)
        摘要:鎘是工業生產和日常生活中廣泛使用的有毒重金屬之一。毒死蜱是農業生產中廣泛使用的有機磷農藥之一。鎘和毒死蜱能夠造成環境污染,通過污染的空氣、土壤、水和食物積累于人類和動物體內,影響人類和動物健康。肝臟為鎘和毒死蜱中毒的靶器官之一。本試驗旨在研究鎘和毒死蜱單一及聯合中毒對鯉魚肝臟的有害影響,為鎘和毒死蜱單一及聯合中毒導致鯉魚肝臟自噬提供基礎數據,為鎘和毒死蜱單一及聯合中毒對鯉魚肝臟的影響提供參考。
          將120條健康鯉魚隨機分為4組,對照組、鎘組、毒死蜱組和鎘毒死蜱聯合組。對照組飼養于去氯自來水中;鎘組飼養于添加CdCl2·2.5H2O(含Cd為0.26mg/L)的去氯自來水中;毒死蜱組飼養于添加毒死蜱(含毒死蜱為14.5μg/L)的去氯自來水中;鎘毒死蜱聯合組飼養于添加CdCl2·2.5H2O(含鎘0.26mg/L)和毒死蜱(含毒死蜱14.5μg/L)的去氯自來水中。每日各組飼喂標準日糧。在試驗的第15、30和45天,每組分別隨機取6條魚處死,迅速切除肝臟組織。觀察鯉魚肝臟組織顯微結構和超微結構,檢測氧化應激指標(H2O2、MDA和GSH含量、CAT、SOD、GPx、GST和T-AOC活性)和自噬相關基因(TOR、LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein、ATG12和ATG5)mRNA表達。結論如下:
          (1)鎘和毒死蜱單一及聯合中毒引起鯉魚肝臟形態學變化。顯微結構變化包括肝細胞空泡化,核致密,胞質濃縮,細胞出現壞死,排列凌亂,細胞間隙紅細胞滲出。超微結構變化包括核膜融合,線粒體空泡化,染色質邊集,出現自噬體。鎘和毒死蜱導致鯉魚肝臟損傷和自噬,且鎘毒死蜱聯合組肝細胞損傷程度和自噬程度強于鎘組和毒死蜱組,表明鎘和毒死蜱具有聯合毒性。
          (2)鎘和毒死蜱單一及聯合中毒增加鯉魚肝臟內H2O2和MDA含量,減少GSH含量,抑制CAT、SOD、GPx、GST和T-AOC活性,導致鯉魚肝臟氧化應激。鎘毒死蜱聯合組鯉魚肝臟H2O2和MDA含量顯著高于鎘組和毒死蜱組,GSH含量、CAT、SOD、GPx、GST和T-AOC活性顯著低于鎘組和毒死蜱組。鎘和毒死蜱單一及聯合中毒導致鯉魚肝臟氧化應激,且鎘毒死蜱聯合組鯉魚肝臟氧化應激強于鎘組和毒死蜱組,表明鎘和毒死蜱具有聯合毒性。此外,鎘毒死蜱聯合組中H2O2含量,鎘組、毒死蜱組和鎘毒死蜱聯合組中CAT活性具有時間效應。
          (3)鎘和毒死蜱單一及聯合中毒抑制鯉魚肝臟內TOR mRNA表達,誘導LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein、ATG12和ATG5mRNA表達,導致鯉魚肝臟自噬。鎘毒死蜱聯合組中鯉魚肝臟TOR的mRNA表達顯著低于鎘組和毒死蜱組,LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein、ATG12和ATG5mRNA表達顯著高于鎘組和毒死蜱組。鎘和毒死蜱單一及聯合中毒導致鯉魚肝臟自噬,且鎘毒死蜱聯合組自噬強于鎘組和毒死蜱組,表明鎘和毒死蜱具有聯合毒性。此外,鎘組、毒死蜱組和鎘毒死蜱聯合組TOR和ATG12mRNA表達,鎘組LC3-ⅡmRNA表達,鎘毒死蜱聯合組Beclin1、Dynein和ATG5mRNA表達具有時間效應。
          鎘和毒死蜱單一及聯合中毒通過氧化應激導致鯉魚肝臟自噬,且鎘和毒死蜱具有聯合毒性。
        [碩士論文] 張江虹
        獸醫 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:鎘是主要的環境污染物之一,它可作為電池材料、生產顏料、油漆、燃料、車胎、塑料等的原料,與我們的生活息息相關。鎘主要通過食物、飲水和空氣等途徑進入機體對肝、腎、肺、腦、骨骼、血液和生殖等多個組織和系統造成不同程度的損傷。目前鎘對雌性生殖系統危害的機制仍不完全清楚。本研究采用自由飲用含氯化鎘的水的孕鼠為動物模型,研究鎘對胎鼠生殖細胞發生的影響及機制。在建立全組織免疫熒光染色3D成像方法的基礎上,分析鎘對胎鼠生殖細胞發生過程中DNA甲基化的影響。
          本文主要從以下幾方面進行論述:
          1.全組織免疫熒光3D成像方法的建立
          為了分析胎鼠生殖細胞的發生過程,在保證性腺完整形態的基礎上,應用特異性的熒光抗體對生殖細胞進行了標記,采用不同的組織透明方法處理后,用激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描,用Imaris軟件生成3D模型,并統計分析性腺分化過程中生殖細胞的數目和分布,并將此結果與組織切片的免疫熒光染色方法得到的結果進行比較。結果表明,全組織免疫熒光3D成像方法能夠很好的顯示性腺分化過程中生殖細胞的分布和數目,Scale A2sucrose為性腺的最優透明化方法。與傳統的組織切片染色方法相比,全組織免疫熒光3D成像方法保持了組織的完整性,并立體展示了細胞在組織的分布,細胞的統計數目更準確。
          2.鎘對雌性胎鼠生殖細胞發生的影響
          為研究鎘對胎鼠生殖細胞發生的影響,將懷孕0.5天的孕鼠隨機分為兩組,實驗組孕鼠自由飲用DDW水配置的含鎘水(64mg/L),對照組孕鼠自由飲用DDW水。分別在懷孕13.5天(13.5dpc)、17.5天(17.5dpc)和出生1天(1d)時,處死孕鼠或仔鼠,采集雌性性腺,用全組織免疫熒光3D成像方法,對雌性性腺中的生殖細胞進行標記,用激光共聚焦顯微鏡逐層掃描,確定生殖細胞在性腺中的分布,利用Imaris軟件生成3D模型,并統計生殖細胞數目。結果顯示,13.5dpc雌性胎鼠的性腺中,免疫熒光染色遍布整個性腺,生殖細胞數目較多且細胞間沒有明顯的界限,無法進行準確的細胞數目統計;但從熒光強度來看,鎘處理顯著降低了13.5dpc雌性胎鼠性腺中的生殖細胞數目。與之相比17.5dpc和1d的雌性性腺中單個生殖細胞清晰可見,生殖細胞主要分布在性腺的邊緣,中間分布較少,生殖細胞的數目分別為2564±65和1836±88,成顯著性降低(P<0.05)。鎘處理后,17.5dpc的雌性性腺中生殖細胞的分布更趨向于性腺的邊緣,數目為2105±67,與對照組相比,成顯著性降低(P<0.05)。鎘處理后,1d的雌性性腺中,生殖細胞的分布與對照組相比無顯著性差異,但數目為1607±59,成顯著性降低(P<0.05)。結果表明,在雌性胎鼠性腺分化發育過程中,生殖細胞數目呈遞減趨勢,鎘處理能顯著加速這一趨勢,并導致仔鼠生殖細胞數目的減少。
          3.鎘對雌性胎鼠性腺DNA甲基化和相關基因表達的影響
          為進一步研究鎘影響雌性胎鼠生殖細胞發生的機制,采集上述模型中13.5dpc、17.5dpc和1d的雌鼠性腺,利用ELISA方法檢測基因組DNA甲基化(5-MC)水平,采用BSP(bisulfite sequencing PCR,BSP)和COBRA方法分析H19、Peg3和LINE1基因的DNA甲基化水平,同時檢測DNMTs和MTs基因的表達水平。結果顯示,在性腺發育過程中5-MC水平呈逐漸下降的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),而鎘處理能在一定程度上阻止5-MC的下降。DNA甲基化分析顯示,在性腺發育過程中,父本印跡基因H19的DNA甲基化水平呈緩慢下降的趨勢,但鎘對其總體上沒有顯著性影響(P>0.05);而母本印跡基因Peg3的DNA甲基化呈逐漸上升的趨勢,鎘干擾了這一趨勢,使其成先升高后下降的趨勢,但總體上看這一影響沒有差異顯著性(P>0.05);重復序列LINE1的DNA甲基化維持在相對穩定的狀態,鎘對其沒有顯著性影響(P>0.05);但是,這三個基因部分位點的DNA甲基化均受到鎘不同程度的干擾。基因表達的分析顯示,DNMT1o只在出生后的雌鼠性腺中表達,DNMT1s在性腺發育過程中表達水平逐漸降低,DNMT3a在出生前的表達水平稍降低而出生后則明顯升高,鎘處理在一定程度上降低了DNMT1o、DNMT1s和DNMT3a的表達水平,但差異均不顯著;在性腺發育過程中,DNMT3b基因未表達;MTⅠ基因表達下降,至出生后不再表達,MTⅡ基因的表達維持相對穩定;鎘對MTs基因表達的影響均不顯著。結果說明,DNMTs基因的表達維持了性腺分化過程中基因組和單個基因DNA甲基化的穩定,鎘對其二者不產生顯著影響,同時,MTs基因的表達也沒有受到鎘的顯著影響。
          4.全文結論
          本研究成功的建立了全組織免疫熒光3D成像的方法,并將其應用到鎘對性腺發育影響的研究中。在雌性性腺發育過程中,生殖細胞數目呈遞減趨勢,鎘處理能顯著加速這一趨勢,并導致仔鼠生殖細胞數目的減少,而在這一過程中,DNA甲基化及其相關基因的表達維持了相對的恒定,同時MTs基因未受鎘的影響,說明鎘處理導致生殖細胞數目的減少可能并不是通過干擾DNA甲基化來完成的。
        [碩士論文] 蔡國棟
        臨床獸醫學 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一種由鐮刀菌屬菌株產生的非甾體伴雌激素樣作用的霉菌毒素,其污染遍布世界各地。ZEA的毒性作用見于生殖系統、內分泌系統和免疫系統等,但相關機制尤其是分子機制還沒有完全探明。目前,關于ZEA暴露對動物免疫細胞中T淋巴細胞活化功能的研究報道較少,為探究ZEA免疫毒性的機理,本實驗以分離的小鼠原代T淋巴細胞為材料,研究了ZEA對T細胞體外活化的信號轉導通路以及活化過程中相關免疫功能的影響。
          本文主要從以下幾方面進行論述:
          1.ZEA對小鼠T淋巴細胞活性及活化標志信號的影響
          采用免疫磁珠負性分選等技術從6-8周齡Balb/c小鼠脾臟中分離獲得原代T淋巴細胞,以0(空白對照),2.5,5,10,20,40,80μM的ZEA同時處理未添加/添加活化劑ConA(5μg/mL)的淋巴細胞48h、72h、96 h,CCK-8法檢測ZEA對T細胞活力的影響;96孔U型底培養板培養細胞觀察細胞聚團現象;流式細胞術檢測ZEA對T細胞各期活化分子的表達。結果顯示,未添加ConA的各染毒組T細胞的活性與對照組相比均無明顯變化(p>0.05); Con A對照組與空白對照組相比細胞活性均明顯上升(p<0.01);48h時20μMZEA及以上濃度處理組細胞活性均明顯低于ConA組(p<0.05或p<0.01),72h及96h時10μMZEA及以上濃度處理組細胞活性均較ConA組極顯著下降(p<0.01),并呈劑量-效應關系。96孔U型培養板培養72h后,空白對照組細胞幾乎看不到克隆團,Con A組出現了大量的克隆團;10μM ZEA處理組細胞聚團現象受到抑制,20μM及40μM ZEA處理組細胞聚集團開始產生皺縮。雙熒光染色流式檢測顯示,與空白對照組比較,ConA組T細胞早、中、晚期活化標志蛋白CD69、CD25、CD71均有大量表達(p<0.01);與ConA對照組相比,10μMZEA及以上濃度處理組T細胞CD69、CD25、CD71陽性表達率均有下降(p<0.05或p<0.01),并呈劑量-效應關系。
          2.ZEA對TCR信號通路的影響
          以小鼠原代T淋巴細胞為材料,設立空白對照組(不含Con A)、ConA(5μg/mL)對照組、ZEA(20及40μM)+ConA(5μg/mL)處理組,共同處理24h后,利用western blot方法檢測TCR信號通路中接頭蛋白LAT的表達水平,活化起始調控蛋白Lck、Zap-70的表達和磷酸化水平,T淋巴細胞活化核因子NF-AT通路和NF-κB通路關鍵蛋白的表達水平,以及核因子NF-AT和NF-κB入核表達的情況;利用流式細胞術分析了不同濃度ZEA(10、20及40μM)對ConA刺激下的T淋巴細胞TCR通路中共刺激分子CD28、CD152的影響。western blot檢測不同濃度ZEA(20μM及40μM)對ConA刺激下的T淋巴細胞活化共刺激分子CD28介導的下游PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響。結果顯示, Con A組細胞LAT表達量較空白對照組明顯上升(p<0.01),不同濃度ZEA處理組LAT的表達量均較ConA組顯著下降(p<0.01),不同濃度ZEA處理組Lck、Zap-70的表達水平及其磷酸化水平均較ConA組下降(p<0.01)并呈現劑量-效應關系,不同濃度ZEA處理組活化核因子NF-AT、NF-κB通路中關鍵蛋白的表達量及它們入核表達水平均較Con A組下降(p<0.05)。隨ZEA染毒濃度的升高,細胞CD28的表達水平呈下降趨勢,40μM ZEA處理組較ConA組差異顯著(p<0.05);10、20μM ZEA處理組細胞CD152分子的表達水平均較Con A組顯著下降(p<0.05),40μM ZEA處理組細胞CD152表達水平較Con A組卻差異不顯著(p>0.05)。不同濃度ZEA處理組細胞CD28介導的下游PI3K-Akt-mTOR信號通路中關鍵蛋白的表達量均較ConA組顯著下降(p<0.05或p<0.01)。
          3.ZEA對活化T細胞細胞因子、趨化因子分泌及趨化因子受體表達的影響
          以小鼠原代T淋巴細胞為材料,設立空白對照組(不含ConA)、ConA(5μg/mL)對照組、ZEA(10、20及40μM)+Con A(5μg/mL)處理組,共同處理培養48h、72h后,利用流式液相多重蛋白定量技術檢測細胞因子IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平;染毒培養24h后,利用流式細胞術檢測T淋巴細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達。結果顯示,ConA組細胞因子IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平均較空白對照組極顯著升高(p<0.01),各濃度ZEA處理組IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF等五種細胞因子的分泌均較Con A組極顯著下降(p<0.01)且呈劑量-效應關系;隨ZEA染毒濃度的升高,細胞趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組MIP-1α分泌量較Con A組顯著降低(p<0.05),40μM ZEA處理組RANTES分泌量較Con A顯著降低(p<0.05);流式雙染結果顯示,Con A組T細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達量均較空白組極顯著升高(p<0.01),隨ZEA染毒濃度的升高,T細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達量均呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組CCR2表達量較ConA組顯著降低(p<0.05),40μM ZEA處理組CCR7表達量較ConA組顯著降低(p<0.05)
          結論,ZEA可通過干擾TCR及共刺激信號通路抑制經Con A刺激的T淋巴細胞活化過程,同時可以抑制活化T淋巴細胞分泌細胞因子及趨化因子的功能,并在一定程度上抑制T細胞參與的趨化效應,從而導致動物機體發生免疫抑制。
        [碩士論文] 司夢雪
        臨床獸醫學 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:玉米赤霉烯酮(ZEA)是由鐮刀菌產生的一種具有雌激素樣作用的毒素,廣泛存在于世界各地的谷類糧食中。研究表明,ZEA結構與17β-雌二醇相似,可拮抗雌激素與受體的結合和調節,影響促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌,導致動物及人類生殖能力的下降。近年來,ZEA可導致雄性動物生殖功能障礙的現象受到人們的關注,但相關機制不明。為探明ZEA雄性生殖毒性的機理,本試驗以分離大鼠原代睪丸支持細胞為材料,對ZEA在體外誘導睪丸支持細胞Fas介導的凋亡進行了研究。
          1.ZEA對大鼠睪丸支持細胞Fas/FasL凋亡信號通路的影響
          為探究ZEA對睪丸支持細胞Fas/FasL凋亡信號通路的影響,采用大鼠原代睪丸支持細胞為材料,用不同濃度ZEA(0、5、10、20μmol/L)處理細胞24h,AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測凋亡率;Westernblot及qRT-PCR檢測死亡受體通路Fas/FasL相關蛋白的表達和轉錄情況。用20μmol/L ZEA處理細胞,于不同染毒時間(0、4、8、16h)使用Western blot檢測凋亡調控蛋白Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase-8的表達。結果顯示,與對照組相比,各染毒組細胞凋亡率呈顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01);10、20μmol/L ZEA能極顯著升高Fas、FasL轉錄水平(P<0.01),20μmol/L ZEA能極顯著的升高FADD和caspase-8的轉錄水平(P<0.01);5μmol/L以上ZEA染毒組Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase8蛋白表達均顯著或極顯著性升高(P<0.05或P<0.01)。隨著ZEA染毒時間的增加,Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase8、cleaved-caspase3的表達量均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)。表明ZEA能誘導睪丸支持細胞凋亡,Fas/FasL途徑參與了ZEA誘導睪丸支持細胞的凋亡過程。
          2.Fas介導的信號通路在ZEA致睪丸支持細胞線粒體凋亡中的作用
          為探究Fas介導的信號通路在ZEA致原代大鼠睪丸支持細胞線粒體凋亡中的作用,用不同濃度的ZEA(0、5、10、20μmol/L)、及20μmol/LZEA與10μmol/L Z-IETD-FMK(caspase-8抑制劑)單獨或聯合作用于原代大鼠睪丸支持細胞,染毒時間均為24h,qRT-PCR檢測凋亡相關基因Bax、Bcl-2的轉錄水平, Western blot檢測Bax、Bcl-2的蛋白表達、細胞色素C的釋放和BID、caspase-9與caspase-3蛋白的活化情況,AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率及流式細胞術結合熒光探針檢測線粒體膜電位(△Ψm)的變化。結果顯示,隨ZEA濃度的升高,睪丸支持細胞促凋基因Bax的轉錄水平和翻譯水平均呈現上升趨勢,抑凋基因Bcl-2的轉錄水平和翻譯水平均呈現下降趨勢,各染毒組Bax/Bcl-2均極顯著高于對照組(P<0.01);與對照組相比,各ZEA染毒組BID的活化均增強(P<0.05或P<0.01),CytC從線粒體釋放到胞漿增多(P<0.05或P<0.01),caspase-9與caspase-3的活化也均增強(P<0.05或P<0.01)。與對照組組比較,caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK組細胞相關指標均差異不顯著(P>0.05);與ZEA組比較,ZEA與Z-IETD-FMK聯合組細胞△Ψm和凋亡率極顯著下降(P<0.01),BID蛋白的活化、CytC從線粒體到胞漿的釋放及caspase-9和caspase-3的活化均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。表明Fas介導的信號通路激活并參與了ZEA誘導的睪丸支持細胞線粒體凋亡的調控。
          3.ZEA致睪丸支持細胞凋亡過程中Fas/FasL和JNK信號通路之間的調控關系
          為研究ZEA致睪丸支持細胞凋亡過程中Fas/FasL和JNK信號通路之間的調控關系,在細胞狀態穩定的情況下,不同濃度ZEA(0、5、10、20μmol/L),20μmol/L ZEA分別與2.5μg/μL Anti-FasL、10μmol/L Z-IETD-FMK或1μg/μL DAXX siRNA單獨或聯合作用于睪丸支持細胞,染毒時間均為24h。Western blot檢測Fas/FasL信號通路中的AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測凋亡率,FADD、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、DAXX、ASK-1、JNK3、p-JNK的蛋白表達量。結果表明,與對照組比較,Anti-FasL組細胞相關指標均差異不顯著(P>0.05);與ZEA處理組相比,Anti-FasL與ZEA共處理組能明顯抑制睪丸支持細胞的凋亡率(P<0.05或P<0.01);蛋白FADD,caspase-8、caspase-9、caspase-3的表達量顯著或極顯著減弱(P<0.05或P<0.01);對照組相比,ZEA處理組中蛋白DAXX、ASK-1、JNK3/p-JNK的表達明顯增強(P<0.05或P<0.01)。與對照組比較,caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK組和DAXX siRNA組細胞相關指標均差異不顯著(P>0.05); Z-IETD-FMK與ZEA共處理組與ZEA處理組相比蛋白DAXX、ASK-1、JNK3/p-JNK的表達量呈顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01);DAXX siRNA與ZEA共處理蛋白能夠明顯減弱ZEA處理引起的caspase-8、caspase-3活化增強(P<0.05或P<0.01)。結果表明,ZEA致睪丸支持細胞凋亡過程中Fas/FasL和JNK信號通路之間可相互調控。
          結論認為,ZEA的雄性生殖毒性可能與其引起睪丸支持細胞的凋亡而影響精子的發育。ZEA能夠誘導大鼠睪丸支持細胞的凋亡,并通過Fas介導的信號通路來完成。Fas介導的凋亡信號通路可直接影響睪丸支持細胞與生精細胞對精子的發育和成熟。
        [碩士論文] CHUNG CHI LE(鐘志禮)
        臨床獸醫學 揚州大學 2018(學位年度)
        摘要:隨著工業的發展,環境中的鎘通過消化道和呼吸道進入生物體內引起鎘的慢性蓄積。骨骼是鎘毒性作用的重要靶器官,長期低劑量的鎘暴露引起骨密度下降,抑制骨礦化。研究表明,鎘能增加成骨細胞RANKL的表達,同時抑制骨保護素(OPG)的表達,進而促進破骨細胞(OC)的分化,同時鎘也能促進破骨細胞前體RAW264.7細胞向OC分化,但鎘調控OC分化的分子機制尚不清楚。鈣離子是細胞中重要的生理調節因子,可以調控細胞的增殖、分化和凋亡等。本文以5-6周齡C57BL/6小鼠的骨髓巨噬細胞誘導形成OC,研究不同濃度鎘處理對OC分化的影響,以及鈣離子和CaM/CaMKs信號在鎘影響OC分化的作用機制。
          1.鎘對OC分化的影響
          采集5-6周齡C57BL/6雄性小鼠骨髓巨噬細胞,以0、20、50、100nM的鎘加入含有30ng/ml M-CSF和60ng/ml RANKL的α-MEM培養基,培養5d后,TRAP染色鑒定OC的形成數量,Western blot檢測OC中NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK蛋白表達水平,RT-qPCR檢測OC相關基因NFATc1、TRAP、c-Fos、CAⅡ的表達變化。結果顯示,隨著鎘濃度的升高,OC的形成數量增加;50、100nM鎘處理使OC的NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK蛋白表達水平呈顯著或極顯著上升,但對NFATc1的基因表達水平沒有顯著影響。表明,低濃度的鎘(50、100nM)能促進OC的分化。
          2.鈣離子信號在鎘影響OC分化中的作用
          為了揭示鈣離子信號在鎘影響OC分化過程中的作用,在骨髓巨噬細胞培養的不同時間采用鈣離子螯合劑BAPTA-AM與鎘共處理,并用2-APB(IP3受體抑制劑)和TG(STIM1鈣離子通道抑制劑)與鎘共處理,Western blot檢測OC中骨吸收相關蛋白NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK的表達,激光共聚焦顯微鏡觀察胞內鈣離子振蕩,TRAP染色鑒定OC的形成數量。結果顯示,隨著鎘濃度的增加(0、20、50、100nM),鈣離子振蕩隨之增強,且BAPTA-AM能顯著降低鎘對OC鈣離子振蕩的增強作用;鎘與BAPTA-AM共處理可以顯著抑制OC骨吸收相關蛋白的表達;2-APB、TG與鎘共處理也能顯著抑制鎘對OC鈣離子振蕩的增強作用,降低OC骨吸收相關蛋白的表達。表明在破骨細胞分化過程中,鎘激活內質網釋放鈣離子到胞漿,增加胞漿內鈣離子的濃度,引起胞漿內鈣離子振蕩,進一步激活NFATc1及其下游蛋白的表達,最終促進OC分化。
          3.Ca2+/CaM/CaMKs信號通路在鎘影響OC分化中的作用
          為了研究Ca2+/CaM/CaMKs信號通路在鎘影響OC分化過程中的作用,用KN-93(CaMKⅡ抑制劑)、W-7(CaM抑制劑)和STO-609(CAMKK抑制劑)與鎘共處理細胞,檢測P-CaM、P-CaMKⅡ、P-CaMKⅣ表達水平的變化。結果顯示,KN-93、W-7、STO-609與鎘共處理,OC陽性細胞數顯著下降,與鎘處理組相比,鎘與KN-93、W-7及STO-609組顯著抑制了鈣離子通道相關標志蛋白P-CaM、P-CaMKⅡ、P-CaMKⅣ表達水平。NFATc1作為Ca2+/CaM/CaMKs的下游分子也是OC分化的重要轉錄因子,在鎘與不同鈣離子通道的抑制劑共處理情況下,NFATc1在核內的表達水平同時受到一定的抑制。由此可見,鎘能夠激活Ca2+/CaM/CaMKs信號通路,同時,CaM可以直接激活CaMKⅤ/CaMKⅡ,增加NFATc1的表達而促進OC分化。
        [碩士論文] 張聰聰
        分析化學 山東大學 2018(學位年度)
        摘要:納米材料的廣泛應用,給人們的生活帶來極大便利。與此同時也可經各種途徑進入人體,對人體健康造成潛在的威脅。作為易感人群,孕婦接觸納米材料后,很可能對子代產生不利的影響。子代的各項機能,如血腦屏障,在懷孕的母體中需要一個發育過程,血腦屏障到胚胎期的15天才能發育完善。已有的研究表明,孕鼠在妊娠期的第16天和第17天連續兩天靜脈注射SiO2和TiO2納米材料,能夠在子代的腦中有納米材料積累。因此孕期暴露,尤其是屏障未發育完全之前,納米材料可能更容易進入子代的腦,進而產生納米材料的積累,并引發不良的生物效應。
          我們的合作者利用nano-ZrO2來處理污水,而此過程nano-ZrO2會不可避免脫落進入水中。因此我們有必要模擬nano-ZrO2分散到水中,對水樣的安全性進行評估。而在血腦屏障形成前后,孕鼠暴露nano-ZrO2,對納米材料在子代腦中分布的影響,尚未見報道。
          本論文中,我們將以孕鼠為模型,在子代血腦屏障形成前后對其口服暴露nano-ZrO2,研究母體可承受的安全劑量范圍,并且在這一安全劑量范圍內,對比研究納米材料在子代的腦中的累積情況。
          第一部分,首先對nano-ZrO2進行物理表征。納米材料的晶型、粒徑、形貌等各種因素都會影響其生物效應。通過X射線衍射來確定ZrO2的晶型,由于ZrO2有三種不同的晶型,所以需要確定所選用的nano-ZrO2是否是我們需要的晶型。此外,通過透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡來了解納米材料的粒徑和均一情況。并且,還需要nano-ZrO2的水合粒徑情況,并分別設置不同的pH以模擬在胃液、體液和腸液中納米材料的存在粒徑以及一段時間的穩定情況。而納米材料也會進入血液中,所以我們又需要加納米材料在胎牛血清中的實驗來進行探究。我們也有必要研究納米材料在不同pH的電位情況,通過電位情況分析納米材料在不同環境中的聚合情況。然而,考慮到普通小鼠體內是否有鋯元素的分布,我們又對不同品系的小鼠器官和血清中鋯元素的含量進行測定,通過以上部分的實驗,為接下來開展的實驗探究奠定了基礎。
          第二部分,考慮到人體和嚙齒動物的諸多相似性,我們以孕鼠為模型,分別在血腦屏障形成前、血腦屏障形成后以及圍血腦屏障階段對孕鼠暴露nano-ZrO2。首先以血腦屏障的發育完善時間即胚胎期的第15天為分界點,在血腦屏障形成前第12天和第13天以及血腦屏障形成后第16天和第17天后各暴露納米材料連續兩天,研究在血腦屏障形成前后納米材料在子代腦組織中的積累情況。而又考慮到孕鼠暴露納米材料后的恢復期問題,所以我們在研究血腦屏障形成前暴露納米材料時又加了一組暴露完即胚胎期第14天馬上檢測,作為對照。另外兩組即是同一時間即胚胎期第18天共同對孕鼠處理。研究表明,在血腦屏障形成前后不同的暴露時間內,納米材料并沒有進入子代的腦中。接下來我們又從胚胎植入期開始,對孕鼠連續暴露14天的納米材料,研究在血腦屏障開始出現前后的整個過程中nano-ZrO2的情況,發現納米材料確實能夠進入子代的腦組織中,但潛在的機理尚不明確。而暴露兩天在子代腦中并未發現有納米材料存在,一方面可能由于暴露的時間比較短;另一種可能是,納米材料在小腸中的攝入比較低。本實驗對處理后的水樣所含nano-ZrO2的安全性提供有力的實驗數據。同時,也對nano-ZrO2處理后的水樣進行了評估,表明在我們的實驗條件下處理后的水樣比較安全。以上實驗結果并為實際可暴露的納米材料水樣濃度做出了合理性預估。
        [碩士論文] 阮嘉雯
        公共衛生 南方醫科大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一種廣泛應用于工業生產中的有機溶劑,同時也是一種常見的環境污染物,TCE職業暴露和環境暴露引起的健康問題成為了人們普遍關注的公共衛生問題。TCE中毒常伴隨著不同程度的肝損傷,然而,TCE致肝臟損傷具體的分子機制尚未清楚。課題組前期研究發現TCE可誘導肝細胞SET表達上調,并證實了SET是TCE致肝細胞毒性的關鍵蛋白。大量研究表明,SET與表觀遺傳調控有著密切的聯系,但是SET如何在TCE致肝細胞毒性中起作用,特別是涉及TCE與SET之間的表觀遺傳調控機制仍有待進一步研究。在課題組前期研究中篩選出TCE作用下肝細胞中表達下調、可能靶向調控SET的miRNA候選分子miR-21a,miR-199b-5p。此外還發現,TCE處理可誘導L-02肝細胞發生DNA損傷,DNA損傷修復蛋白p53表達上調,進一步研究表明,SET蛋白可在一定程度上抑制p53的表達。利用蛋白質組學研究發現SET可介導組蛋白H3K79二甲基化(H3K79me2)修飾水平降低。在此基礎上,本研究深入探索了SET上下游的表觀遺傳調控機制及其在TCE致肝細胞毒性中的作用。本研究主要分成以下兩個方面內容:
          研究內容1:miRNA調控SET在TCE致肝細胞毒性中的作用
          方法:在前期篩選肝細胞中可能靶向作用于SET的miRNA(miR-21a,miR-199b-5p)的基礎上,雙熒光素酶報告系統檢測miR-21a,miR-199b-5p與SET之間的靶向調控關系;進一步利用Western blot檢測miRNA高表達與穩定干擾L-02肝細胞中SET的變化。流式細胞術分析TCE處理后正常L-02肝細胞、miRNA穩定高表達及穩定干擾的肝細胞凋亡的變化。
          結果:雙熒光素酶報告基因和Western blot檢測結果表明miR-199b-5p可以與SET-3'UTR結合,從而部分抑制SET表達。細胞流式檢測結果表明,TCE處理后,與正常L-02肝細胞比較,miR-199b-5p低表達時凋亡率明顯升高,提示miR-199b-5p可以在一定程度上緩解TCE誘導的肝細胞凋亡。
          結論:L-02細胞中miR-199b-5p可以與SET-3'UTR結合,從而部分抑制SET表達,在一定程度上緩解TCE誘導的肝細胞凋亡。
          研究內容2:SET通過介導H3K79me2調控p53在TCE致肝細胞DNA損傷中的作用
          方法:以L-02細胞與SET缺陷L-02細胞為受試細胞,0mmol/L、8mmol/LTCE處理24h后,通過染色質免疫共沉淀結合熒光定量PCR技術(CHIP-qPCR)檢測DNA損傷修復基因p53啟動子區域H3K79me2修飾水平。通過siRNA靶向抑制肝細胞中H3K79特異性甲基轉移酶Dot1L,進一步分析H3K79me2對p53的表觀遺傳調控作用以及p53在TCE致肝細胞DNA損傷修復中發揮的關鍵作用。
          結果:前期研究顯示,TCE致肝細胞毒性作用中,SET能部分抑制p53表達。本研究發現,TCE作用下,L-02肝細胞與SET缺陷L-02肝細胞中p53啟動子區域組蛋白H3K79me2修飾水平上調。通過抑制肝細胞中H3K79甲基化轉移酶Dot1L后發現,H3K79me2修飾水平下調時,p53表達也降低。彗星實驗結果表明,當p53表達被抑制時,TCE誘導的L-02肝細胞DNA損傷加重。
          結論:SET通過介導p53啟動子區域H3K79me2降低,部分抑制DNA損傷修復蛋白p53的表達,而p53表達下調在一定程度上會加劇TCE致肝細胞DNA損傷。
        [碩士論文] 趙晶
        公共衛生與預防醫學 武漢科技大學 2018(學位年度)
        摘要:目的:
          本研究以4-壬基酚(4-Nonylphenol,NP)為受試物,以SD雄性大鼠和睪丸支持細胞(Sertoli cells,SCs)為研究對象,應用生物光譜技術研究NP的雄性生殖毒性效應。
          方法:
          1、用對照組(玉米油)、系列濃度(25、50、100mg/kg)NP腹腔注射,每兩天一次,連續20天染毒不同日齡(21、35、50日齡)SD雄性大鼠,構建動物模型;取睪丸組織、提取原代睪丸細胞后,分別用Raman光譜和ATR-FTIR光譜檢測大鼠睪丸組織和細胞的生物化學改變;
          2、用對照組(DMSO)、系列濃度(2.5、5、10和20μM)NP對睪丸SCs進行染毒培養24h,細胞經消化、洗滌、固定后用ATR-FTIR檢測;
          3、采用主成分分析和線性判別分析(PCA-LDA)對獲取的圖譜進行多變量分析。
          結果:
          1、ATR-FTIR檢測不同日齡大鼠的睪丸細胞,NP暴露組和對照組之間集群分離明顯;且除了脂質區50日齡組中25mg/kgNP暴露組(P>0.05),其他暴露組與對照組的差異均具有統計學意義(P<0.001),并且顯示出劑量-效應關系;聚類向量分析顯示不同NP暴露下各組發生變化的生物標記物不同且與對照組相比具有明顯的差異(P<0.001);在不同NP暴露下脂質與蛋白質比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ比率及磷酸鹽與碳水化合物比率相比對照組均存在顯著性差異(尸<0.001);
          2、ATR-FTIR分析不同濃度NP暴露下體外培養的睪丸SCs,NP暴露組和對照組集群圖是分離開的,且在LD1平面NP暴露組和對照組效應差異顯著(P<0.001);聚類向量分析顯示各組發生變化的生物標記物不相同且與對照組相比具有明顯的差異(P<0.001);在不同NP暴露下脂質與蛋白質比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ比率及磷酸鹽與碳水化合物比率與對照組相比差異有統計學意義(P<0.001);
          3、Raman分析不同日齡大鼠的睪丸組織,觀察到各組大鼠的睪丸間質組織遠離對照組,且不同NP暴露組與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.001)。聚類向量分析顯示各組發生變化的生物標記物不相同且與對照組相比具有明顯的差異;在不同NP暴露下脂質與蛋白質比率、不飽和脂肪水平與對照組相比差異有統計學意義(P<0.001);
          結論:
          1、通過體內體外實驗發現,不同濃度的NP對于睪丸組織和細胞產生的效應是不同的,而且伴有劑量效應關系;同時對不同的日齡大鼠所產生的的效應也各不相同;
          2、通過檢測細胞的生物分子特征性變化,發現NP暴露可以干擾睪丸SCs和睪丸間質細胞脂代謝和糖代謝等細胞代謝過程,對睪丸細胞增殖活性有影響,也可以誘導蛋白質二級結構發生改變.
        [博士論文] 劉洋
        環境科學 山東大學 2018(學位年度)
        摘要:由于具有良好的特性,表面活性劑被廣泛應用于個人護理、洗滌產品等各領域。隨著相關行業的發展,其產量及用量仍在迅速增長。這些產品在使用后,殘留的表面活性劑在環境中聚集,影響地表水及土壤的環境甚至是生態系統的穩定性,同時通過食物鏈的富集作用甚至是直接接觸進入人體,隨血液循環系統分布到全身各處。其中,全氟表面活性劑作為一種持久性有機污染物,其在體內造成的潛在毒性及生物積累性,已引起全球廣泛關注。表面活性劑進入機體后會誘發一系列的毒性效應,在動物、細胞及分子層面均有報道。但是,目前對于表面活性劑在血液傳輸過程中造成的毒性作用的報道還較少,其毒性作用的效應和機理,尚未闡明。同時,隨著全氟辛烷磺酰基化合物的禁用,對其替代品進入機體后是否會造成明顯的毒性,目前尚無定論。為了更好地評價和闡明表面活性劑在血液傳輸過程中造成的毒性效應與作用機理,本研究從細胞和分子層面上研究了三種不同類型表面活性劑在血液傳輸過程中造成的毒性效應與作用機理。
          第一章介紹了環境中表面活性劑的污染現狀以及表面活性劑毒性效應的研究進展,概述了氧化應激、氧化損傷及其調控和作用機制。通過文獻綜述,總結了本領域的研究進展和目前存在尚待解決的科學問題,并針對這些問題設計了本論文的研究方案。
          第二章以轉運蛋白人血清白蛋白(HSA)與牛血紅蛋白(BHb)為靶蛋白,從分子層面上研究了不同類型表面活性劑對蛋白結構、功能的影響及機理。
          (1)以轉運蛋白HSA為靶蛋白,從分子層面上研究并比較了陰、陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與HSA的相互作用的效應與機制。結果表明,兩種小分子均主要通過靜電作用力與HSA結合,并且對HSA的結構及功能造成影響。隨著CTAB濃度的增加,HSA的骨架結構變松散,α-螺旋含量從51.6%降低至36.8%,β-折疊含量從7.5%增加至14.9%;SDS濃度的增加未使骨架結構發生明顯變化,僅使HSA的α-螺旋含量降低3.2%,β-折疊含量增加2.9%。可以看出,CTAB對HSA結構造成的影響明顯強于SDS。隨著SDS的加入,HSA的酯酶活性受到明顯抑制,嚴重影響HSA的催化功能;CTAB的加入會使HSA的酯酶活性先升高后下降,高濃度時對HSA酯酶活性的抑制弱F于SDS。結合分子對接的結果,由于SDS與HSA結合在酯酶活性中心區域,與關鍵氨基酸殘基直接發生相互作用,因此抑制了HSA的酯酶活性。CTAB未與HSA結合在酯酶活性中心區域,在高濃度下對HSA的骨架及二級結構造成的影響間接抑制HSA的酯酶活性。
          (2)以轉運蛋白HSA為靶蛋白,從分子層面上研究并比較了三種不同碳鏈長度的全氟表面活性劑全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟己烷磺酸(PFHS)及全氟丁烷磺酸(PFBS)與HSA的相互作用的效應與機制。研究結果表明,三種小分子均通過靜電力與疏水作用力與HSA結合,其中靜電作用力占主導地位。隨著三種小分子的加入,對HSA的骨架及二級結構未發生明顯變化。隨著PFOS濃度的增加,HSA的α-螺旋含量升高1.8%,β-折疊含量降低3.7%;隨著PFHS濃度的增加,HSA的α-螺旋含量降低2.5%,β-折疊含量升高1.5%;而PFBS的加入使HSA的二級結構未發生明顯變化。分子模擬結果顯示,三種小分子均與HSA結合在酯酶活性中心區域,與關鍵氨基酸殘基發生相互作用,阻止底物進入酯酶活性中心,因此抑制了HSA的酯酶活性。當達到最高濃度時,HSA的酯酶活性分別降低約70%,60%及50%,可以看出,三種小分子對HSA結構及功能的影響隨碳鏈長度的增長而增強。
          (3)以轉運蛋白BHb為靶蛋白,從分子層面研究并比較了全氟表面活性劑PFOS、PFHS及PFBS與BHb的相互作用的效應與機制。結果表明,三種小分子均與BHb通過靜電與疏水作用力結合,其中靜電作用力占主導地位。隨著三種小分子的加入,BHb中色氨酸(Trp)及酪氨酸(Tyr)殘基所處的微環境未發生明顯變化,但分子模擬的結果表明,PFOS與PFHS與BHb結合在了關鍵的Trp37殘基附近,造成的影響較未結合在該關鍵區域的PFBS所造成的影響大,這與BHb熒光光譜的變化情況相一致。隨著三種小分子濃度的增加,BHb的骨架結構未發生明顯變化,二級結構中α-螺旋含量分別升高3.81%、2.62%與1.90%。PFOS的加入抑制了BHb結合氧的能力,并引起了高鐵血紅素的生成,對BHb運輸氧的生理功能造成影響。而PFHS與PFBS的加入則未對BHb運輸氧的功能造成明顯影響。這說明三種小分子對BHb結構及功能的影響隨碳鏈長度的增長而增強。
          第三章以血細胞為靶細胞,從細胞層面上研究了不同類型表面活性劑在血液傳輸過程中對紅細胞及白細胞產生的毒性效應。
          (1)以紅細胞及白細胞為靶細胞,利用光譜學手段及細胞實驗,評價并闡述了不同碳鏈長度的全氟表面活性劑PFOS、PFHS及PFBS在血液傳輸過程中對紅細胞及白細胞產生的毒性效應。研究結果表明,三種小分子對紅細胞的結構并未造成明顯影響,但會影響紅細胞的正常生理功能。4h暴露下,隨著三種小分子的加入,血液總抗氧化能力輕微上升,緩解氧化應激對血液產生的氧化損傷。但當濃度達到最高時,血液的抗氧化系統不足以應對三種小分子引起的氧化應激,過量的活性氧物質(ROS)誘發氧化損傷,造成血液總抗氧化能力降低。24h暴露會影響白細胞活力,導致白細胞凋亡比例增加,造成細胞中ROS含量升高。這些結果說明三種小分子在血液傳輸的過程中引起了氧化應激并對血細胞產生了毒性,且毒性隨著碳鏈長度的增強而增強。
          (2)以紅細胞及白細胞為靶細胞,利用光譜學手段及細胞實驗,評價并闡述了陰、陽離子表面活性劑SDS與CTAB在血液傳輸過程中對紅細胞及白細胞產生的毒性效應。實驗結果表明,低濃度下兩種小分子的加入會影響紅細胞的正常生理功能,當SDS濃度高于1×10-5mol/L,CTAB濃度高于5×10-6mol/L時,兩種小分子會使紅細胞出現明顯的溶血現象,破壞紅細胞的結構。4h暴露下,隨著兩種小分子的加入,血液總抗氧化能力及氧化應激相關指標上升,緩解氧化應激對血液產生的氧化損傷。但當濃度達到最高時,血液的抗氧化系統不足以應對兩種小分子引起的氧化應激,過量的ROS誘發氧化損傷,造成相關指標降低。而24h的暴露會引發更明顯的毒性效應,導致白細胞活力明顯下降,白細胞中晚期凋亡細胞及死細胞的比例上升,白細胞中ROS含量明顯升高。這些結果說明兩種小分子在血液傳輸的過程中引起了氧化應激并對血細胞產生了毒性,且CTAB表現出的毒性作用強于SDS。
          第四章結合各部分研究的實驗結果,以PFOS作為全氟表面活性劑的代表,比較三種類型表面活性劑對HSA及血細胞產生的毒性效應與機理的異同。
          從分子層面,低濃度條件下,三種小分子的添加對HSA的骨架及二級結構未造成明顯影響,表現出一定的相似性。有所不同的是,在濃度達到1×10-5mol/L后,CTAB會對HSA的骨架及二級結構造成明顯影響,而SDS與PFOS對HSA的骨架及二級結構未造成明顯影響。由于與HSA結合在酯酶活性中心區域,SDS與PFOS的加入使HSA的酯酶活性受到明顯抑制,且隨著濃度的升高,SDS對HSA酯酶活性的抑制明顯強于PFOS。而CTAB的加入使HSA的酯酶活性先上升后下降,雖未與HSA結合在酯酶活性中心區域,但高濃度下對HSA結構造成的影響間接抑制了HSA的酯酶活性。三種表面活性劑對HSA結構的影響由強到弱依次為CTAB、SDS、PFOS,但由于結合位置的不同,三種表面活性劑對HSA酯酶活性的影響由強到弱依次為SDS、PFOS、CTAB。
          從細胞層面,4h低濃度暴露下,三種表面活性劑對紅細胞生理功能的影響由強到弱依次為CTAB、SDS、PFOS。在高濃度下,SDS與CTAB會使紅細胞出現明顯的溶血現象,破壞紅細胞的結構,而PFOS未對紅細胞的結構造成明顯影響。隨著三種小分子的加入,SDS與CTAB會造成血液總抗氧化能力及氧化應激相關指標的升高,提高血液對氧化應激的抵抗能力;而PFOS僅使血液的總抗氧化能力輕微上升。但當濃度達到最高時,抗氧化系統不足以應對三種小分子引起的氧化應激,過量的ROS誘發氧化損傷,造成相關指標降低。經24h暴露后,三種小分子對白細胞均表現出一定的毒性作用,造成白細胞凋亡比例增加,白細胞中ROS含量明顯升高。有所不同的是,SDS與CTAB會造成白細胞活力的明顯下降,且CTAB造成的影響較SDS明顯,而PFOS則未對白細胞活力造成明顯影響。總的來說,三種表面活性劑對血細胞的毒性由強到弱依次為CTAB、SDS、PFOS。
          第五章對論文的工作進行了總結,歸納了本研究中的創新點,分析了研究方法的不足,并展望了該領域的發展方向。
        [碩士論文] 李彤
        環境科學與工程 山東大學 2018(學位年度)
        摘要:大氣污染問題已成為現階段影響我國居民身體健康和城市空氣質量的首要因素,并呈現出多介質影響、多污染源疊加的復合污染特征。作為大氣污染物的核心,大氣顆粒物,尤其是超細顆粒物(ultrafine particles,UFPs)對人體的健康效應一直受到各國政府與組織的關注。由于具有粒徑小、比表面積大,數量濃度高,能夠吸附多種污染物形成復合污染的特點,UFPs在機體內表現出獨特的生物學效應,被認為與人體呼吸系統、免疫系統以及心血管系統疾病密切相關。
          UFPs在生物體內能引起炎癥反應和氧化應激等毒性效應。UFPs主要由呼吸道、消化道等途徑進入機體,通過作用于肺泡上皮細胞和巨噬細胞,激活相關信號通路,改變細胞膜通透性,促進炎性細胞因子的轉錄和表達,誘發機體炎癥反應和氧化應激。此外,UFPs能夠穿過上皮與內皮細胞屏障,通過血液循環系統作用于肝臟、脾臟等組織和器官,引起更廣泛的氧化損傷。目前毒理學領域關于UFPs的研究多集中于對肺部細胞的生物學效應,UFPs在其他器官和組織內所引起的毒性效應和作用機理尚未闡明,尤其是UFPs與生物大分子結合的機制更是缺乏相應的基礎研究數據。因此,從分子和細胞多層次探究UFPs進入血液循環后的生物學效應和毒性作用機制具有十分重要的意義。
          鑒于UFPs成分復雜,難以分析各成分的劑量效應關系,本論文選取性質穩定的惰性顆粒超細炭黑(ultrafine carbon black,UFCB)作為研究大氣中UFPs生物學效應的模型。實驗以UFCB誘發機體氧化應激效應入手,以小鼠重要的免疫器官脾臟和血液中常見兩種消化酶作為研究對象,從分子和細胞水平上探究UFCB經過血液循環對生物大分子相互作用以及器官中蓄積誘發細胞氧化應激的毒性機理。本文主要包括下列四方面內容:
          論文首先闡述了目前我國大氣污染的特征以及顆粒物污染研究的進展;從理化性質、分子毒性與細胞毒性等多個角度闡述了UFPs與UFCB的攝入機制、對機體的生物學效應和毒性作用機理;綜述了流行病學和納米毒理學關于該領域污染物最新研究進展和目前存在的問題;概述了本實驗的研究方法與機理。
          第二部分選取小鼠體內脾細胞作為研究對象,通過檢測脾細胞活力、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)以及兩種抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活力等與氧化應激相關生物標記物水平變化,探究了短期暴露下UFCB對脾細胞的氧化損傷效應。研究表明,低劑量UFCB(<5-15ug/ml)能夠引起小鼠脾細胞較弱氧化應激效應,但在細胞調控及抗氧化體系作用下,CAT與SOD活力上升,呈現低劑量興奮效應,使細胞ROS水平處于穩定范圍內,MDA含量上升不明顯,脂質過氧化效應較弱,ROS對細胞的氧化損傷效應并不明顯。但當UFCB達到較高濃度(>15ug/ml)時,UFCB暴露誘發脾細胞內產生并積累過量的ROS,SOD、CAT活力下降,細胞內發生脂質過氧化反應,誘發氧化應激,脾臟發生氧化損傷,最終引發脾細胞活性下降甚至凋亡。
          第三部分以血液中常見的消化酶之一α-淀粉酶為靶蛋白,使用多種光譜手段和酶活性檢測技術,從分子水平上探究了短期UFCB暴露對α-淀粉酶的結構與功能的影響。實驗結果表明,納米顆粒UFCB進入機體后可以迅速的與α-淀粉酶以形成蛋白冠的方式結合。二者的結合改變了α-淀粉酶的構象和氨基酸殘基的微環境,引起了蛋白熒光的規律增敏和骨架收縮,氨基酸殘基疏水性增強。此外,酶活性實驗表明隨著UFCB暴露劑量的增加,酶活性下降為空白組的84.7%,說明二者的結合位點可能位于酶活性中心附近,影響了其活性表達。
          第四部分以血液中另一種常見的消化酶脂肪酶為研究對象,探究了短期UFCB暴露對脂肪酶結構與功能的影響。研究表明,UFCB與脂肪酶的結合模式與α-淀粉酶類似,二者均以蛋白冠的形式結合。隨著UFCB暴露劑量的增加,脂肪酶活性下降為對照組的77.9%,說明二者結合位點位于活性中心附近,影響了酶活性的表達。二者的結合還改變了脂肪酶的二級構象和氨基酸殘基微環境,使其熒光規律增敏,蛋白骨架緊縮,氨基酸殘基疏水性增強。
          本論文從分子和細胞兩個層面探究了UFCB進入機體血液循環后,其潛在的生物大分子毒性和細胞氧化應激毒性效應,建立了UFCB與生物大分子的作用模型,為完善UFPs在血液循環系統中的生物學效應提供了基礎數據和理論依據。
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